[发明专利]一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法

说明书

本发明公布了一种黑曲霉种子连续培养的方法，所述方法包括如下步骤：(1)启动阶段，将黑曲霉孢子接种至种子培养基，得到种子液；(2)种子连续培养阶段，对步骤(1)得到的种子液进行连续分散处理，分散得到的种子液进行连续培养，并同时补充新鲜种子补料培养基；(3)停止阶段，停止补充新鲜种子补料培养基和分散处理，继续培养得到种子液，移入发酵培养基进行发酵培养。本发明方法突破性解决了多细胞丝状菌生长缓慢，以及菌丝球在连续培养中容易流失的问题，完全实现了种子连续培养，使菌体恒定在最适的生长环境中，避免了菌种退化，使种子液处于连续稳定的高活力状态，对应发酵产柠檬酸的性能提高。

技术领域

本发明涉及微生物培养的技术领域，尤其是涉及一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是世界上生产量和使用量最大的有机酸，是一种重要的化工产品，具有广泛的用途。柠檬酸主要用于食品工业，如酸味剂、抗氧化剂、胶凝剂等，而且医药、饲料、化工、电子、纺织等工业领域都有十分广阔的应用，市场需求量逐年增加。我国是最大的柠檬酸生产和出口国，生产工艺先进，市场竞争力强，特别是独创以玉米、薯干等淀粉质原料的深层发酵指数居世界前列。

虽然近年来生物发酵技术不断快速发展，新的发酵技术不断涌现，多种高效率的连续培养方式在不同发酵产品上得到广泛应用，但由于柠檬酸生产菌种黑曲霉是多核丝状真菌，其生长特性和菌体形态完全不同于酵母和细菌等单细胞微生物，以酵母和细菌为生产菌株的高效成熟的发酵方式并不能很好的应用于黑曲霉柠檬酸发酵生产中，严重制约了柠檬酸等以丝状菌作为生产菌株的发酵产业发展。

当前，柠檬酸发酵生产仍然沿用传统的方式，即先制备大量的黑曲霉孢子；再将孢子接入种子培养基中培养获得成熟的种子液；然后将种子液移入发酵培养基中发酵得到柠檬酸发酵液。柠檬酸传统发酵方式存在以下问题：

(1)黑曲霉孢子制备繁琐、周期长、效率低：黑曲霉菌种需要经过复壮，平板筛选和三级扩培，制备周期超过30天；人工操作繁琐，染菌风险大。

(2)菌种稳定性、一致性差：当前孢子制备机械化程度低，麸曲培养容器小，在不同容器内一致性较差，导致种子培养质量和发酵结果不稳定。

(3)种子培养效率低：孢子接种至种子培养需要8～12h的萌发时间，降低了种子罐的利用效率。

(4)种子分批间歇培养不稳定：分批间歇培养中，菌体生长环境(如糖浓度、pH等)在不断变化，导致菌体生长无法长期处于最适的环境中。

目前行业内还没有丝状菌的种子连续培养方法，原因在于丝状菌一般为多细胞，生长慢，成块、成球，在连续培养中细胞容易流失。常见的连续培养主要集中在细菌、酵母等种类的微生物方面，它们都是单细胞，形态简单，容易控制。专利CN201410329652.X公布了一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养的方法，虽然称为“连续”培养，但其本质为“循环”培养，该方法是将前一批剩余的分散菌丝接种至新的种子培养基培养成种子液来实现种子的循环培养。该方法虽然减少了孢子使用量和节省了孢子的萌发时间；但是种子需要在不同罐体内进行切换培养，设备系统增加，操作相对繁琐；而且每一批种子液仍然采用分批间歇培养的方式进行，培养环境在不断变化，无法保障种子在最适的环境条件下生长，不仅存在批次间的不稳定，更为重要的是容易导致菌种衰退，影响发酵水平。因此，目前行业内还没有产生真正的种子连续培养方法。

相比专利CN201410329652.X中分批间歇培养，黑曲霉种子连续培养需要克服以下技术难点：(1)菌体生长慢；菌丝球容易流失；(2)减少菌种传代次数，避免菌体退化；(3)确定合适的种子液停留时间，避免菌体流失过快，同时保障移种种子液中菌体量充足，且保证培养环境稳定；(4)确定合适的菌丝大小，使菌体生长速率和稀释速率达到平衡。