[发明专利]油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用

说明书

本发明属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用，本发明提供了L.biglobosa的特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到112 fg/μL的L.biglobosa基因组DNA，为油菜黑胫病菌的田间检测、口岸快速高通量检验检疫等提供了很好的工具。

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及油菜黑胫病菌特异性序列及LAMP检测引物和应用。

背景技术

油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernando et al.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。小球腔菌属(Leptosphaeria)真菌包括两个近缘种：Leptosp haeria maculans和L.biglobosa(Shoemaker and Brun.,2001)(Kaczmarek.,2009)。前者主要分布于加拿大、澳大利亚、欧洲等地，侵染部位在油菜茎基部，会造成茎基腐从而茎秆倒伏，对油菜生产危害严重，造成的损失大；后者全球均有分布，严重侵染十字花科作物，主要引起茎上部病斑，危害油菜生产(Fitt et al.,2006b)。L.maculans具有极强的致病力，是造成世界各地油菜产量损失的重要原因，为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010)(周圆等，2016)。

这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(West et al.,2001)，而我国目前仅报道了Leptosphaeria biglobosa，尚没有发现L.maculans。自2006年以来，随着我国油菜种植面积的减少，对进口油菜籽的需求量逐年攀升，极大增加了该病菌传入的几率(陈明爱等，2008)。目前，我国从欧洲、加拿大和澳大利亚等油菜主产区进口300多万t油菜籽，同时也从欧洲各国及日本、新西兰等国家进口十字花科蔬菜种子，这些地区均有油菜茎基溃疡病菌的分布记录(孙颖等，2015)。2010年湖北出入境检验检疫局在加拿大进境的油菜籽中首次检出油菜茎基溃疡病菌(L.maculans)(王振华等，2010)。油菜黑胫病菌的检测方法只有形态学观察法、聚合酶链式反应(PCR)检测方法和发病症状观察法。但由于，现存的检测方法周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、准确性低等劣势，难以满足口岸的高通量快速检测要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于口岸检测油菜黑胫病菌显得尤为重要。

目前对于油菜黑胫病菌的分子检测仅有PCR方法(Liu et al.,2006)，Liu根据L.biglo bosa和L.maculans的ITS序列(利用引物ITS4和ITS5扩增L.maculans菌株UK7以及L.biglobosa菌株UK5,UK21和UK28获得)，利用L.biglobosa和L.maculansITS上一段相同的碱基序列设计一条共同反向引物，另外分别设计两条共向引物，结果根据扩增得到的片段大小，将两菌区分，但其特异性不足，在进行实际PCR扩增操作时，常会将其他物种的全基因组DNA也扩增出与L.biglobosa同样大小的基因片段。因此，在L.biglobosa的分子检测上仍需要进行完善。