[发明专利]一种阪崎克罗诺杆菌CRISPR分型方法

权利要求书

1.一种非疾病的诊断和治疗目的的阪崎克罗诺杆菌CRISPR分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 提取待检测菌株培养物的DNA；

b. 分别取适量步骤a的DNA作为模板，进行CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点的扩增引物为E-1F和E-1R，CRISPR2位点的扩增引物为E-2F和E-2R、CRISPR3位点的扩增引物为E-3F和E-3R；对CRISPR3位点进行PCR扩增时，若E-3F和E-3R扩增出条带，则加扩CRISPR6位点，若无扩增出条带，则不需要加扩CRISPR6位点，其中CRISPR6位点的扩增引物为E-6F和E-3R6R；

所述的引物E-1F，其序列如SED ID NO.1所示，

所述的引物E-1R，其序列如SED ID NO.2所示，

所述的引物E-2F，其序列如SED ID NO.3所示，

所述的引物E-2R，其序列如SED ID NO.4所示；

所述的引物E-3F，其序列如SED ID NO.5所示，

所述的引物E-3R，其序列如SED ID NO.6所示；

所述的引物E-6F，其序列如SED ID NO.7所示，

所述的引物E-3R6R，其序列如SED ID NO.8所示；

c. 分别对步骤b所述的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点的PCR扩增产物进行DNA测序；

d. 提取CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位点序列中的间隔序列，根据间隔序列的组合确定阪崎克罗诺杆菌的CRISPR型别；

所述的步骤b的PCR扩增，其扩增体系为：采用50 μL的PCR扩增体系，其中含有HS DNAPolymerase 0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5 μL，待检细菌DNA模版1~2 μL，补齐ddH₂O至50 μL；扩增条件为：98℃预变性1min，然后98℃ 10 s，57~58℃ 5 s，72℃ 4 min，共30次循环；72℃延伸5 min；

所述的步骤b中，若利用引物E-3F和E-3R经PCR扩增反应后检测无条带，则利用引物E-3F和E-3R6R进行PCR扩增CRISPR3位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的DNA测序引物为步骤b的PCR扩增引物。