[发明专利]烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用

说明书

本发明公开了一种烟草eIF4E‑1突变位点特异性共显性分子标记，与野生型位点检测相关的标记命名为ASM‑W，片段大小543bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基插入突变位点检测相关的标记命名为ASM‑m，片段大小543bp，如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了一种用于鉴别上述突变位点特异性共显性分子标记的引物，引物序列如SEQ ID NO.3、4、5所示。利用该标记和引物可以对PVY抗性供体亲本的回交转育后代的基因型进行准确选择。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于烟草种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有开阳小黑烟eIF4E‑1突变类型的种质材料或转育后代。

技术领域

本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种烟草真核生物翻译起始因子eIF4E-1的突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒烟草种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的烟草材料，提高eIF4E-1突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的一种烟草系统性侵染病害。此病引起的损失因烟草侵染时期和病毒株系不同而异，早期感染的脉坏死株系，可导致绝产绝收，若近收获期感染或感染弱株系，则减产相对较轻，一般损失25-45％。PVY除引起产量损失外，更为严重的是病叶烤晒后色泽和烟味较差，品质显著降低。

选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表现为隐性基因(va)控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出与Va位点相关的分子标记(RAPD、SCAR)。烤烟种质RY5对PVY坏死株系(PVYN)的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点(Va)紧密连锁的RAPD标记O12V3695与SCAR标记PVY ME1。文献报道的RAPD标记和SCAR标记，与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM。与PVY抗性的连锁距离较远，将导致利用标记数据判断抗性表型误差较大。同时RAPD标记存在扩增产物的特异性不高，非目标条带干扰结果判断、PCR扩增需要循环数多达45个循环等不足。

已有研究表明eIF4E为Va基因位点的一个隐性抗PVY基因，即感PVY基因。2014年，国外学者采用新一代测序技术比较烟草抗感PVY近等基因系转录组，明确了烟草eIF4E-1基因(GenBank登录号KF155696)为烟草PVY隐性抗病基因。2015年，云南省烟草农业科学研究院刘勇等根据烟草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，开发出一个与PVY抗性紧密连锁的显性分子标记(专利申请号：2014101504706)，其通过在烟草野生型eIF4E-1基因的第1个外显子内设计上游引物(CF2)，在内含子区域设计下游引物(GR11)，获得在供试抗病品种中无扩增条带，而在感病品种中有特异条带的引物对。该标记能将部分抗病烤烟(或白肋烟)品种与感病品种区分开来，但不能有效区分野生型eIF4E-1的纯合和杂合基因型，例如申请人通过序列分析和PCR验证，发现应用CF2/GR11引物在6份PVY抗病晒烟品种和8份PVY感病烤烟或晒烟品种中均能扩增出大约的特异性条带(如图1所示)，因此其不能有效地将这些烟草PVY抗感品种区分开来，在回交转育突变型eIF4E-1位点时，不能直接利用该分子标记进行辅助选择。

发明内容

为克服现有分子标记的不足，本发明针对获得的一个eIF4E-1位点的碱基插入突变体提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的共显性标记并用于标记辅助选择。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记进行辅助选择育种，对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。