[发明专利]一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法

权利要求书

1.一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，其特征在于，该脱毒方法的详细步骤如下：

S1、彩色马蹄莲花蕾的取材与预处理

在11月~12月彩色马蹄莲现蕾时期，选择晴天上午取材，将摘得的花蕾装入冰壶中带回实验室，筛选花粉小孢子处于单核靠边期的花蕾，置于32℃热激处理2d；

S2、花蕾消毒与花药预处理

将上述花蕾用自来水冲洗20~30min，置于超净工作台中，先用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗2~3次，再用0.1%升汞+2~3滴吐温-80浸泡8min，用无菌水冲洗3~4次；在解剖镜下用镊子拨开花蕾取出花药放在0.2mol/L的甘露醇溶液中预处理3d；

S3、花药接种与诱导培养

将上述预处理后的花药用无菌滤纸吸干表面多余的液体，然后接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种40~50枚花药，置于温度24~26℃，相对湿度65~75%的黑暗条件下培养，培养48~60d可诱导出淡黄色的愈伤组织；

S4、愈伤组织增殖培养

将步骤S3获得的愈伤组织转接到增殖培养基上继续培养，每30d继代一次，继代2~4次后可获得大量的愈伤组织；培养条件控制为温度24~26℃，相对湿度65~75%，光照强度1500~2000Lux，光照10h/d；

S5、愈伤组织分化培养

无菌条件下将上述获得的愈伤组织分别转接到分化培养基上，置于23~27℃、相对湿度65~75%、光照强度1800~2200Lux、光照12~14h/d的培养条件下进行愈伤组织分化培养，培养28~34d后愈伤组织分化出不定芽；

S6、水培生根

待步骤S5中分化出的不定芽长到1.5~2.0cm时，将小芽从愈伤组织上切下，接种到生根培养液中，进行水培生根；培养条件控制为温度22~25℃、相对湿度60~80%、光照强度2500~3000Lux、光照15~17h/d，培养22~28d可得到长出5~8条根系的彩色马蹄莲幼苗；

S7、炼苗与移栽

待彩色马蹄莲幼苗长到10cm左右时，将组培瓶移到温室大棚中，大棚的温度控制在20~27℃、湿度控制在80%~90%，将组培瓶的瓶口打开，在自然光光照的条件下炼苗5~7d；将幼苗从组培瓶中取出，移栽入大棚的栽培基质中，定期浇水和营养液，进行常规栽培管理；

S8、彩色马蹄莲非二倍体植株的剔除

移栽后的彩色马蹄莲幼苗生长到现蕾期时，将非二倍体植株剔除，剩余的则为彩色马蹄莲正常二倍体植株。

2.根据权利要求1所述的一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，其特征在于，所述步骤S1中筛选花蕾的方法为：将花蕾中的花药挑取2~4枚碾碎，释放出花粉，用DAPI染色后镜检确认小孢子发育时期为单核靠边期。