[发明专利]HBV转基因小鼠原代肝细胞的分离、培养与鉴定的方法

权利要求书

1.一种HBV转基因小鼠原代肝细胞的分离、培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)原代肝细胞的分离：无菌条件下将预热37℃的灌注液I注入肝门静脉，至肝脏膨起1-2倍后扎破下腔静脉，放血待肝脏回缩到原来大小，继续注入注灌注液I 5～12min后，更换为预热37℃的灌注液II，当小鼠肝脏变软变白轻压有明显凹陷停止灌注并将小鼠肝脏解剖游离，将肝脏的被膜破裂收集处理后的肝细胞；

2)肝细胞的纯化：用无菌的细胞过滤器将步骤1)收集的肝细胞进行过滤，再经离心后加培养基重悬，细胞计数后接种培养。

2.根据权利要求1所述的分离、培养方法，其特征在于，步骤1)中灌注液I为含质量百分数为0.05～0.15％的葡萄糖和2～3mmol/L的EGTA的无菌的PBS，PH值为7.35～7.45。

3.根据权利要求1所述的分离、培养方法，其特征在于，步骤1)中灌注液II为含4～6mmol/L的氯化钙和0.3～0.7mg/ml的IV型胶原酶的无菌的PBS，PH值为7.35～7.45，灌注速度为6～10rpm。

4.根据权利要求1所述的分离、培养方法，其特征在于，步骤2)中细胞过滤器为100um的细胞过滤器。

5.根据权利要求1所述的分离、培养方法，其特征在于，步骤2)中用DMEM/F12培养基重悬小鼠原代肝细胞，再将原代肝细胞以最佳浓度接种于无菌的铺有鼠尾胶原的细胞培养皿中培养。

6.根据权利要求5所述的分离、培养方法，其特征在于，细胞培养皿中培养的方法为：用6mM冰醋酸将鼠尾胶稀释到40～60ug/ml，均匀铺平培养皿，平均厚度约为0.8～1.0mm，包被浓度为6～8ug/cm²。

7.权利要求1中分离、培养后的HBV转基因小鼠原代肝细胞的鉴定方法，其特征在于，包括原代肝细胞形态学鉴定、功能学鉴定(白蛋白与糖原检测)和HBV的表达分析(HBV DNA与相关蛋白表达分析)。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，功能学鉴定中小鼠原代肝细胞白蛋白检测的方法包括以下步骤：

1)小鼠原代肝细胞爬片培养20～28h，PBS缓冲液清洗，晾干后滴加5％的多聚甲醛，固定25～35min；

2)将固定后的细胞爬片用PBS缓冲液清洗后孵育于山羊血清工作液10～20min，弃工作液后用白蛋白抗体4℃过夜；PBS缓冲液作为空白对照来代替小鼠白蛋白抗体；

3)将白蛋白抗体处理后的细胞爬片经PBS缓冲液清洗，加生物素标记的山羊抗兔的IgG，室温下孵育10～20min后用PBS缓冲液清洗；

4)将步骤3)处理后的细胞爬片加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温下孵育10～20min后用PBS缓冲液清洗，滴加DAB显色液，用蒸馏水冲洗后再滴加苏木素进行复染；

5)复染后的细胞爬片用蒸馏水冲洗干净后，依次用75％、95％和无水乙醇对细胞爬片进行脱水处理，再用二甲苯进行透明处理，树胶封片后镜检拍照观察。

9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，功能学鉴定中小鼠原代肝细胞糖原检测的方法包括以下步骤：

1)小鼠原代肝细胞爬片培养20～28h，PBS缓冲液清洗，晾干后滴加5％的多聚甲醛，固定25～35min；

2)将固定后的细胞爬片用PBS缓冲液清洗晾干后加过碘酸溶液，室温避光孵育8～10min，蒸馏水冲洗干净后加入Schiff试剂，室温避光孵育15～25min；蒸馏水冲洗干净后再加入苏木素染色液复染30-60s，蒸馏水冲洗、树胶封片后镜检拍照观察。

10.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，小鼠原代肝细胞中HBV的表达分析的方法为：提取HBV转基因小鼠原代肝细胞中的DNA和上清样本，采用PCR、RT-PCR、Westernblot及ELISA方法检测细胞内和上清样本中HBV DNA、HBV RNA、HBsAg和HBcAg的表达水平，同时检测细胞上清样本中HBeAg的表达。