[发明专利]一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法

说明书

本发明属于细胞研究技术领域，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法。本发明稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，包含以下步骤：(1)设计并合成引物；(2)根据绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti‑puro‑GFP；(3)无内毒素提取验证载体pLenti‑puro‑GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti‑puro‑GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti‑puro‑GFP质粒送去测序检测GFP‑LC3的序列情况；(4)用载体pLenti‑puro‑GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收取病毒上清，将病毒上清转染喉癌细胞Hep‑2，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在高内涵下观察，直至获得稳定株。

技术领域

本发明属于细胞研究技术领域，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母中发现的一种蛋白质，当水母发光蛋白结合Ca²⁺后发出蓝色荧光，该蓝光进一步激发GFP产生绿色荧光。GFP激发后发出的荧光持续时间较长，且不需要任何其他辅助因子的作用，GFP的cDNA成功克隆及在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功表达后，人们认识到它的巨大应用前景。

喉癌是头颈癌常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高复发率的特点，其发病率在各国各地的差异很大。至今为止喉癌的治疗仍以手术为主，但手术不仅影响了患者的生理功能，同时也给患者带来了很大的精神困扰，所以对其研究至关重要。构建稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株，对于喉癌发生发展机制的研究、高通量和高内涵分子靶向药物筛选、以及动物模型中监测肿瘤生长转移等具有重要的推动作用，为喉癌生物标志物筛选及治疗靶点的挖掘提供细胞学基础。

目前尚无商品化的表达荧光蛋白的喉癌稳定细胞株，在很大程度上限制了针对喉癌的靶向药物筛选和分子机制研究。因此筛选稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株对喉癌及相关领域的基础及临床转化研究具有重要的意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种慢病毒质粒为骨架的绿色荧光蛋白表达载体，并通过病毒包装、感染喉癌细胞Hep-2及筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，包含以下步骤：

(1)根据绿色荧光蛋白基因的序列信息，设计并合成引物，以pEGFP-C1载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光蛋白的基因序列；

(2)根据绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti-puro-GFP；

(3)无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti-puro-GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti-puro-GFP质粒送去测序检测GFP-LC3的序列情况；

(4)用载体pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收取病毒上清，将病毒上清转染喉癌细胞Hep-2，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在高内涵下观察，直至获得稳定株。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(1)所述的绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ.ID.NO.1；pLenti-puro序列的基因序列如SEQ.ID.NO.2；载体pLenti-puro-GFP的基因部分测序结果的序列如SEQ.ID.NO.3