[发明专利]用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用

权利要求书

1.用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA，所述的sgRNA在人OC-2基因上的靶序列符合5'-N(20)-NGG3'或5'CCN-N(20)-3'的序列排列规则，在人OC-2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：

所述sgRNA在人OC-2基因的靶向位点位于人OC-2基因的1号外显子上；所述的sgRNA对应的核苷酸序列选自如下情况之一：

(1)为sgRNA#1：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG；

(2)同时包含sgRNA#1，sgRNA#2，sgRNA#3:

sgRNA#1：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG；

sgRNA#2：

TTTGGTGAGGCATCGATAGG；

sgRNA#3：

GTCTTTGGTGAGGCATCGAT。

2.一种CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于：

含有权利要求1所述的靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于：

所述的CRISPR/Cas慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR经BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的权利要求1所述的靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA重组得到。

4.一种慢病毒，其特征在于：

含有权利要求2或3任一项所述的CRISPR/Cas慢病毒载体。

5.一种利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在权利要求1所述的特异性sgRNA的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据权利要求1所述的特异性sgRNA获得其对应的DNA互补链，并且在其5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；

(2)将步骤(1)得到的双链与Cas载体连接，得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)得到的重组表达载体与包装系统共转染包装细胞，收获病毒后纯化、浓缩，得到病毒颗粒；

(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳定转染的细胞，得到成功敲除OC-2基因的细胞。

6.根据权利要求5所述的利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的Cas载体为Cas9载体；

步骤(3)中所述的包装细胞为293T细胞；

步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体为psPAX2和/或pMD2G；

步骤(4)中所述病毒颗粒为至少一种含有权利要求1所述的特异性sgRNA的病毒颗粒；

步骤(4)中所述的细胞为卵巢癌细胞。

7.根据权利要求6所述的利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的Cas载体为lentiCRISPRv2载体；

步骤(4)中所述病毒颗粒为含有sgRNA#1的病毒颗粒，或者为含有sgRNA#1的病毒颗粒、含有sgRNA#2的病毒颗粒和含有sgRNA#3的病毒颗粒按1:1:1混合得到的混合物；

步骤(4)中所述的细胞为人卵巢癌细胞株SKOV3或CAOV3。

8.权利要求1所述的用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA或权利要求2～3任一项所述的CRISPR/Cas慢病毒载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。