[发明专利]正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法

权利要求书

1.一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤；所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44；四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达miR10b、沉默miR200a和过表达CD44；所述正常肝干细胞为WB-F344。

2.根据权利要求1所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法的具体步骤包括：

A、构建可诱导慢病毒载体系统，得到慢病毒载体；

A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统，转录因子为TG737和miR200a，得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体；

A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统，转录因子为miR10b和CD44，得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体；

B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞，挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆，得到肝癌干细胞。

3.根据权利要求2所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：还包括步骤C、肝癌干细胞培养：

C1、培养：将步骤B的肝癌干细胞采用Williams's E培养基培养，得到培养后肝癌干细胞；

C2、转染：将培养后肝癌干细胞用加入了慢病毒载体的聚凝胺-基质培养基培养，得到转染肝癌干细胞；

C3、克隆：将转染肝癌干细胞用完全培养基依次进行培养，传代培养后，得到传代肝癌干细胞；

C4、药物筛选：从传代肝癌干细胞中药物筛选出肝癌干细胞。

4.根据权利要求3所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述步骤C1的具体步骤是：步骤B的肝癌干细胞在12孔板中，以2×10⁵个肝癌干细胞/孔，每孔加入1mL含有质量分数为10％的FBS的Williams's E培养基。

5.根据权利要求4所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述步骤C2中培养后肝癌干细胞的密度为肝癌干细胞饱和密度的50-70％；所述步骤C2中慢病毒载体为步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带转录因子的慢病毒载体；慢病毒载体的加入量为10ug/孔；聚凝胺-基质培养基的加入量为1mL/孔，每空中聚凝胺的最终浓度为5ug/mL；所述步骤C2的培养时间为12h。

6.根据权利要求5所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述步骤C3的培养的时间为12h；传代培养的时间为48h；传代培养转染肝癌干细胞的比例为1:3。

7.根据权利要求6所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法，其特征在于：所述药物筛选的药物为嘌呤霉素二盐酸盐，所述嘌呤霉素二盐酸盐在每孔中最终的浓度为10ug/mL。