[发明专利]一种通过孢子直接诱导的苔藓组培及成苗培养方法

权利要求书

1.一种通过孢子直接诱导的苔藓组培及成苗培养方法， 其特征在于，包括以下步骤：

(1)孢子体的选择和前处理

在苔藓孢蒴和孢梗变黄褐色、蒴帽尚未脱落时，选择孢蒴饱满的孢子体，将孢蒴剪下放入培养皿内，先在紫外灯下培养28～32分钟，再在光照强度为3000lx的日光灯光下培养2～4天，培养温度22～28℃；

(2)孢子收集

当步骤(1)培养的孢蒴的蒴帽开始脱落，有孢子散出时，切开孢蒴或用镊子挑开蒴帽让孢子散出，收集得到苔藓孢子；

(3)孢子直接消毒

将步骤(2)获得的孢子放在离心管中，按孢子：3％w/w过氧化氢溶液的体积比为1：10～20的比例加入3％w/w过氧化氢溶液，摇动6～10分钟后，获得消毒孢子与过氧化氢的混合液；

(4)孢子萌芽诱导

每培养瓶内装入苔藓孢子萌芽诱导培养基33ml，用经过消毒的移液管或滴管吸取步骤(3)获得的消毒孢子与过氧化氢的混合液接种到培养瓶内的苔藓孢子萌芽诱导培养基表面，并轻轻摇动使所述消毒孢子与过氧化氢的混合液均匀分布其表面，进行孢子萌芽诱导培养48天，孢子萌发形成芽孢和原丝体，孢子萌芽诱导培养条件为：温度22℃，光照强度2500lx，最初1～5天的光照时间为20小时/天，第6天以后光照时间8小时/天；所述苔藓孢子萌芽诱导培养基为：改良MS+KT 0.6mg/L+GA₃ 0.2mg/L+琼脂6g/L+白糖20g/L，pH值为6.0；

(5)芽孢和原丝体的继代增殖

在新的培养瓶内装入固体继代增殖培养基，每培养瓶装入的固体继代增殖培养基为35ml，先在步骤(4)孢子萌芽诱导培养获得的芽孢和原丝体的培养瓶内加入6ml无菌水，摇动后形成高浓度芽孢和原丝体悬浮液，用无菌接种匙或接种环将高浓度芽孢和原丝体悬浮液接种到固体继代增殖培养基表面进行继代增殖培养，继代增殖培养31天后，固体继代增殖培养基表面形成绿色菌落状芽孢和原丝体，每瓶高浓度芽孢和原丝体悬浮液接种10～15瓶盛有固体继代增殖培养基的培养瓶，继代增殖培养条件为：温度22℃，光照强度2500lx，光照时间8小时；所述固体继代增殖培养基为：改良MS+BA 0.8mg/L+2，4-D 0.2mg/L+IAA0.3mg/L+琼脂7g/L+白糖20g/L，pH值为6.0；

(6)振荡分化培养

在经步骤(5)培养后形成了绿色菌落状芽孢和原丝体的培养瓶内，每瓶内加入无菌水15ml稀释成稀释悬浮液，将稀释悬浮液与液体培养基按稀释悬浮液：液体培养基的体积比1：5混合得到混合液，然后将混合液在转速100r/min的摇床上震荡培养25天，所述摇床上震荡培养条件为：温度22℃，光照强度2500lx，光照时间8小时，待混合液变稠且颜色为深绿色时得到深绿色悬浮液；所述液体培养基为：改良MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+白糖20g/L，pH值为6.0；

(7)喷涂接种和成苗培养

苔藓苗培苗基质装入育苗盘内，所述苔藓苗培苗基质按如下方法配制而成：将草炭、蛭石和锯末按照草炭：蛭石：锯末体积比为6：1：1比例混合而成；

将步骤(6)培养获得的深绿色悬浮液加水稀释得稀释液，稀释比例按深绿色悬浮液：水的体积比＝1：15～20，用喷施方式或涂涮方式将稀释液喷施或涂涮到苔藓苗培苗基质表面，并将育苗盘放于大棚内的苗床上进行成苗培养，在育苗盘的上方加盖小拱棚并于小拱棚上覆盖无色塑料薄膜，在无色塑料薄膜上覆盖遮光率为75％的遮阳网，成苗培养条件为：从进行成苗培养的第1天至第15天，保持小拱棚内的空气相对湿度90～95％，第16天至第30天，每天间隔揭开小拱棚上的无色塑料薄膜通气，保持小拱棚内的空气相对湿度为85～90％，第31天至完成成苗培养，每天早上10点前和晚上5点以后揭开小拱棚上的无色塑料薄膜透气，保持小拱棚内的空气相对湿度75～85％，从第1天至完成成苗培养期间，白天控制大棚内温度在20～28℃，夜间控制大棚内的温度不低于15℃，并保持苔藓苗培苗基质表面湿润，当苔藓苗培苗基质表面形成苔藓植株时即完成成苗培养；

步骤(3)至步骤(6)均无菌条件下操作；

步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中所述的各培养基中的改良MS为：

KNO₃ 950mg/L，NH₄NO₃ 825mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L， KH₂PO₄ 85mg/L，CaCl₂·2H₂O220mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.15mg/L，ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L，H₃BO₃ 3.1mg/L， KI 0.415mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.125mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.0125mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.0125mg/L，Na₂-EDTA18.65mg/L，FeSO₄·4H₂O 13.9mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 140mg/L。