[发明专利]一种细菌生物膜胞外DNA提取方法

说明书

本发明公开了一种细菌生物膜胞外DNA提取方法，该方法首先采用纤维素酶联合蛋白酶K对细菌生物膜进行酶解处理，然后通过微滤、离心、沉淀等步骤，能够将大部分结合态eDNA从生物膜中分离出来，从而提高了胞外DNA的提取产量，同时还能降低生物膜中细菌的死亡率，从而减少细胞裂解对产物造成的影响。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种细菌生物膜胞外DNA提取方法。

背景技术

细菌生物膜是微生物在生长过程中为了适应生存环境而形成的与浮游细胞相对应的存在形式。细菌生物膜的特殊结构和其对耐药性的影响是造成很多慢性顽固性感染的原因。胞外DNA(eDNA)来自于死亡细菌体裂解释放或活菌主动分泌，是细菌生物膜胞外基质中的重要成分之一，eDNA在生物膜形成、成熟及转化方面发挥着重要作用。

关于eDNA的提取，目前使用最多的是酶解法，已有研究表明，采用N-糖酰胺酶从不动杆菌生物膜中提取的eDNA，其产量较对照组提高了60到190倍，并且没有可观测的细胞裂解。eDNA可以分为游离态和结合态，提取结合态eDNA是提取生物膜中eDNA的关键步骤。虽然采用化学方法如SDS和NaOH处理能提取更多的eDNA，但是死活染色和显微镜观测结果表明化学提取过程中有大量细胞膜损坏，这可能会导致基因组DNA释放，从而影响eDNA的质量。酶处理能降解基质并释放结合态eDNA，前人研究了N-糖酰胺酶处理从大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌生物膜中提取的eDNA量不一样，将N-糖酰胺酶和蛋白酶K结合处理能显著提高eDNA的提取量。但是，N-糖酰胺酶作为降解多糖的一种酶，在提取枯草芽孢杆菌和恶臭假单胞菌生物膜中的eDNA量很低。到目前为止，其它多糖降解酶在提取生物膜eDNA中应用很少。

发明内容

本发明的目的是解决现有存在的问题，提供一种细菌生物膜胞外DNA提取方法，该方法具有产量高，细胞裂解影响小等优点。

本发明采用的技术方案如下：

1)取生物膜样品，配制成OD₆₀₀为1～3的细胞悬液，然后加入5～20μg/ml纤维素酶，35～40℃孵育10～60min，再加入2～10μg/ml蛋白酶K，35～40℃孵育30～120min；

2)将酶解后的细胞悬液用0.1～0.5μm滤膜过滤，收集滤液，1～5℃离心，取上清；

3)在上清中加入0.05～0.3倍体积的1～5mol/L乙酸钠溶液与1～5倍体积的无水乙醇，-30～-10℃过夜后再次离心，将沉淀物用无水乙醇洗涤，烘干，即得。

优选地，所述细菌生物膜胞外DNA提取方法包括以下步骤：

1)取生物膜样品，配制成OD₆₀₀为2的细胞悬液，然后加入10μg/ml纤维素酶，37℃孵育30min，再加入5μg/ml蛋白酶K，37℃孵育60min；

2)将酶解后的细胞悬液用0.2μm滤膜过滤，收集滤液，4℃离心，取上清；

3)在上清中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠溶液与2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜后再次离心，将沉淀物用无水乙醇洗涤，烘干，即得。

优选地，所述细菌为枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌。

本发明的有益效果是：

本发明首先采用纤维素酶联合蛋白酶K对细菌生物膜进行酶解处理，然后通过微滤、离心、沉淀等步骤，能够将大部分结合态eDNA从生物膜中分离出来，从而提高了胞外DNA的提取产量，同时还能降低生物膜中细菌的死亡率，从而减少细胞裂解对产物质量造成的影响。

附图说明

图1是不同酶降解法提取枯草芽孢杆菌和恶臭假单胞菌生物膜胞外DNA的凝胶电泳图。