[发明专利]一种鉴别葡萄卷叶病毒3和葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法

说明书

本发明涉及一种鉴别葡萄卷叶病毒3(GLRaV‑3)与葡萄茎痘病毒(GRSPaV)的双重PCR引物及方法，步骤如下：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板对GLRaV‑3的HSP70蛋白部分编码序列和GRSPaV的衣壳蛋白部分编码序列进行PCR扩增；(4)对步骤(3)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明涉及上述PCR引物组合，利用双重PCR方法来进行GLRaV‑3与GRSPaV的鉴定，结果准确、方法快速简便，节约检测成本，大大提高了病毒检测效率，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

葡萄卷叶病毒3(Grapevine leafroll associated virus-3，GLRaV-3)与葡萄茎痘病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV)是葡萄上的两种重要病毒，给葡萄生产造成严重威胁。GLRaV-3具有半隐性特征，受感染的葡萄在大部分季节不能表现出明显症状，多数在秋季症状最为明显，表现为叶面翻卷，脉间变红或者变黄，只有主脉保持绿色。GLRaV-3会导致葡萄产量和含糖量降低、成熟期延迟、果实着色不良等。GRSPaV于1998年被确认，是一种发生普遍，危害严重的葡萄病毒，感染该病的葡萄植株会表现出开花延迟、生长衰退、嫁接成活率低等症状。随着GLRaV-3与GRSPaV的发生流行及其给葡萄生产带来的重大经济损失，实现快速灵敏的分析鉴定，是预防与控制病毒病的首要选择。因此，开发快速准确、简便经济的可以同时检测GLRaV-3与GRSPaV两种病毒的方法，是一项有现实意义的工作。

传统的GLRaV-3的检测方法为抽取病株DNA，以DNA模板，利用GLRaV-3的特异引物进行常规PCR检测(董雅凤，张尊平，杨俊玲，何峻，张少瑜.葡萄卷叶病毒3RT-PCR检测技术研究.中国果树，2005(6)：9-12)。传统GRSPaV的检测方法为抽取病毒RNA，将RNA反转录成cDNA，再以cDNA模板，利用GRSPaV的特异引物进行常规PCR检测(李西萍，牛建新，张强，赵英.葡萄茎痘病毒病的RT-PCR检测[J].果树学报，2005(06)：119-120)。利用上述传统方法检测GLRaV-3或GRSPaV侵染的植株，需要分别进行RT-PCR操作，在不同PCR体系中进行检测，操作步骤繁琐且耗时。

多重PCR(multiple PCR)技术又称多重引物PCR或复合PCR技术，是常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新型的PCR扩增技术，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个不同的DNA片段。本专利利用多重PCR技术，针对GLRaV-3的HSP70蛋白部分编码区和GRSPaV衣壳蛋白部分编码区的核酸序列设计扩增GLRaV-3和GRSPaV双重PCR特异引物，仅需样品的cDNA作为模板，便可在同一PCR体系中快速鉴别GLRaV-3和GRSPaV两种病毒，尤其对GLRaV-3和GRSPaV混合感染的植株更为实用。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量，大大提高了检测的效率，节省了检测的人力、物力和财力，在田间GLRaV-3或GRSPaV病毒的监测上具有独特的优势和极高的使用价值。

目前利用双重PCR技术构建快速鉴别GLRaV-3和GRSPaV的方法未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法。

一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物，所述引物为两对，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核普酸序列与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4与所示的核苷酸序列。

正义引物GLRaV-3-F：5’-TTGCCGCAGATATCTAAAGTCG-3’；SEQ ID NO.1