[发明专利]一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌，其特征在于，是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的，所述2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选择含有壮观霉素抗性基因、归巢内切酶I-SceI特异识别作用位点、多克隆位点MCS、能在苏云金芽胞杆菌BMB171中复制的温敏型初始质粒，获取将要敲除的prpD基因上下游同源片段依次克隆到初始质粒中获得敲除载体；

（2）将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株；

（3）将含有卡那霉素抗性基因、能够编码I-SceI酶的诱导质粒导入所述单交换菌株，在选择平板上选择获得第二次同源重组并实现靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株；

（4）挑取经PCR验证的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株在无选择压力的条件下转接3~5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株，即为2-甲基柠檬酸高产基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：通过PCR技术，以出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171的总DNA为模板，分别扩增prpD靶基因上游和下游长度为0.7~1kb的同源序列片段，将上述同源序列片段依次连接到初始质粒上获得敲除载体。

4.根据权利要求3所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述初始质粒为pRP1028，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的方法为三亲本杂交法，将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的具体步骤为：将所述敲除载体转化大肠杆菌DH5α,获得含有敲除载体的供体菌，然后将供体菌与苏云金芽胞杆菌BMB171在辅助菌株的作用下将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌中。

6.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述诱导质粒为pSS4332，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

7.一种利用如权利要求1所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌生产2-甲基柠檬酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将2-甲基柠檬酸高产基因工程菌于28℃,200rpm下培养12~18h，收集菌液；

（2）将收集的菌液离心获得菌体并利用超声破碎以及有机溶剂前处理获得2-甲基柠檬酸粗品。

8.根据权利要求7所述的生产2-甲基柠檬酸的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体步骤为：将收集的菌液离心弃去上清，加入去离子水重悬，加入的去离子水与原菌液的体积比为2~4:7，置于冰浴水中用超声破碎仪破碎，离心收集上清，加入8~10倍体积的丙酮剧烈震荡30~90s，12000rpm离心5min，除去上清，将得到的棕黄色沉淀在烘箱中烘干，然后用去离子水重悬棕黄色沉淀，去离子水与原菌液的体积比为3~10:700，加入乙腈，乙腈与去离子水的体积比为2:3，剧烈震荡，12000rpm离心5min，取上清，加入5~10倍的乙腈，剧烈震荡，12000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀置于烘箱中烘干，即得到2-甲基柠檬酸粗品。