[发明专利]小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用有效

申请号：	201811004480.3	申请日：	2018-08-30
公开（公告）号：	CN109006917B	公开（公告）日：	2021-09-21
发明（设计）人：	胡松青;张亚萍;侯轶;刘光毅	申请（专利权）人：	华南理工大学
主分类号：	C12N9/08	分类号：	C12N9/08;A21D8/04;C12N15/53;C12N15/81
代理公司：	广州市华学知识产权代理有限公司 44245	代理人：	崔红丽
地址：	511458 广东省广州市***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	小麦过氧化氢酶改善面粉加工品质中的应用
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【权利要求书】：

1.小麦过氧化氢酶在改善面团及面包品质中的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的小麦过氧化氢酶在面粉中的添加水平为1000～3000U/g面粉。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

编码所述小麦过氧化氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的小麦过氧化氢酶通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得；

所述的真核重组表达载体为包含小麦过氧化氢酶基因的真核重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：

（1）小麦过氧化氢酶基因的克隆

以小麦基因组为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到过氧化氢酶基因，纯化回收PCR产物；

F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；

R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；

（2）重组表达载体的构建

将酵母真核表达载体与步骤（1）所得的PCR产物分别用Xho I和Xba I双酶切，连接所得双酶切产物并转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆菌株，抽提质粒，得到小麦过氧化氢酶重组表达载体；

（3）小麦过氧化氢酶重组表达菌株的构建

将步骤（2）所述的小麦过氧化氢酶重组表达载体线性化后转化至毕赤酵母中，使用步骤（1）所述的引物进行毕赤酵母基因组PCR，筛选得到阳性重组表达菌株；

（4）将步骤（3）所得的阳性重组表达菌株接种至BMGY液体培养基中，25～35 ℃、150～250 r/min条件下过夜振荡培养；3000g条件下常温离心5min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀转接至BMMY液体培养基中，转接后的菌液OD_600nm为1.0～5.0；25～35 ℃、150～250 r/min条件下继续培养48～120h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5%～2.5%v/v，固液分离后获得发酵上清液；即得小麦过氧化氢酶重组表达产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，还包括：

（5）将步骤（4）所得发酵上清液经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：

步骤（1）中，所述的小麦为“烟农19”品种小麦；

步骤（2）中，所述的酵母真核表达载体为酵母真核表达载体pPICZαA；

步骤（2）中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5a；

步骤（3）中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33；

步骤（4）中，所述的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L；

步骤（4）中，所述的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤（5）中，所述的硫酸铵盐析分级沉淀第一次沉淀所用硫酸铵浓度为15～30%饱和度，第二次沉淀为45～60%饱和度；所述的阴离子交换层析所用层析柱为Mono Q柱。