[发明专利]一种黄鳝抗菌肽的制备方法

说明书

本发明提供了一种黄鳝抗菌肽的制备方法，属于基因工程技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与Triton X‑100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。所述方法获得的黄鳝抗菌肽表达量高、活性好，对多种细菌均有抑制作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种黄鳝抗菌肽的制备方法。

背景技术

黄鳝是一种底栖小型鱼类，黄鳝肉质细嫩，鲜美可口，营养价值高等特点，因此受到大众的欢迎，出现供不应求的局面。我国已经开始大规模的人工养殖黄鳝，随着养殖规模不断扩大，养殖黄鳝的疾病发生率越来越高，而传统的抗生素虽然对于细菌有杀灭作用，但是长期使用，细菌的耐药性增加，黄鳝对细菌抵抗能力下降，最终会导致养殖过程的细菌疾病不断增加。寻找黄鳝养殖过程中抗生素的安全替代品，减少抗生素的使用，是降低黄鳝疾病率的关键。

黄鳝抗菌肽是黄鳝体内受到外界刺激时所分泌的一类小分子肽类，具有生物活性。对于寄生虫，细菌，病毒均会产生抑制作用，具有广谱抗菌活性。黄鳝抗菌肽主要是自然杀伤细胞与淋巴细胞分泌的蛋白物质，黄鳝NK-lysin抗菌肽基因的阳离子与疏水性结构组成能够细胞膜裂解，抑制细菌的核酸的形成，阻止了细菌的快速繁殖。机体受到外来细菌的侵袭时，抗菌肽迅速分泌，保护机体免受外来细菌的伤害。但是目前对于黄鳝抗菌肽的制备多采用直接提取或原生表达的方法，表达量低，表达活性低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达量高，活性高的黄鳝抗菌肽的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种黄鳝抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与Triton X-100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。

优选的，步骤3)中所述诱导培养时间为47～49h。

优选的，步骤3)中重组菌株的接种体积为0.9～1.1％。

优选的，步骤3)中接种重组菌的OD₆₀₀为0.8～1.2。

优选的，步骤3)中所述诱导培养过程中添加甲醇。

优选的，所述蜗牛酶孵育的温度为35～40℃，所述蜗牛酶孵育的时间为50～70min。

优选的，所述蜗牛酶与菌体细胞的质量比为(6～8)：200。

优选的，所述载体为pPIC9K载体，所述黄鳝抗菌肽基因连接在载体中EcoRI和NotI酶切位点之间。

优选的，所述连接体系包括以下组分：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，黄鳝抗菌肽基因3μL，载体1μL，T4 DNA Ligase 1μL和ddH₂O 4μL。

优选的，所述连接的温度为3～5℃，所述连接的时间为10～14h。

本发明还提供了上述制备方法制备获得的黄鳝抗菌肽在制备鱼类饲料中的应用。