[发明专利]一种利用近红外光谱测定发酵液中聚苹果酸含量的方法

说明书

本发明涉及一种利用近红外光谱测定发酵液中聚苹果酸含量的方法，包括以下步骤：将含有不同浓度的聚苹果酸的发酵上清液样品扫描近红外光谱，得到样品的红外光谱数据；（2）采用酸水解结合高效液相色谱法测量上述发酵上清液，得到样品的聚苹果酸的浓度；（3）利用偏最小二乘回归算法，联立样品的红外光谱数据和样品的聚苹果酸浓度，建立聚苹果酸浓度的测定模型；（4）输入待测发酵上清液样品的红外光谱数据，利用所述测定模型计算发酵上清液样品中的聚苹果酸浓度。本发明依据近红外光谱的基本原理，开发一种利用近红外光谱的方法定量测量出芽短梗霉发酵液中的聚苹果酸浓度方法，可以在测量过程中减少污染和能耗，降低成本，提高操作效率。

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种一种利用近红外光谱测定发酵液中聚苹果酸含量的方法。

背景技术

出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属，又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”、“出芽短梗霉”及“短梗霉”，是一种和酵母有密切联系的、具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。利用出芽短梗霉进行发酵能够得到聚苹果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及单细胞蛋白等产物。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸和化学合成法相比，具有成本低、反应条件温和、分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意。

发酵液中聚苹果酸的测量，传统方法包括高效液相色谱法，2，7‐二羟基萘浓硫酸比色法以及酶反应法等。要想使用这些方法，首先要将聚苹果酸水解成苹果酸单体，然后再用上述三种方法测量单体苹果酸含量，对比水解前后的差值，算得聚苹果酸的浓度。但是聚苹果酸水解需要用到大量的硫酸，以及100‐120摄氏度的高温，具有污染，耗能的缺点。2‐7二羟基萘浓硫酸法测定时也存在这个问题，而且还往往伴随严重的副产物干扰。而液相色谱法和酶反应法则存在着仪器，试剂昂贵和样品处理复杂等不足。因此，寻找一种环保，方便，快捷并相对准确的测量方法，对于生物法生产聚苹果酸具有重要意义。

红外吸收光谱是由于物质分子中的化学键或官能团能够选择性的吸收特定频率的红外光谱，使自身的振动能级或转动能级发生跃迁而产生的吸收谱带。特定的化学键或官能团的红外吸收频率与自身化学键的类型，以及邻近分子的相互作用和溶剂的种类有关。因此通过对红外吸收光谱的谱图进行分析，理论上可以得知物质的分子结构，再根据朗伯比尔定律，可以对特定的进行定量分析。

基频，指的使红外光谱中某一化学键或官能团的基础吸收频率，按量子的观点即物质中分子振动的能级由基态跃迁至第一激发态所吸收的红外光的频率。相应的，分子振动的能级也可以吸收更多的能量，直接由基态跃迁至第二激发态，第三激发态。。。第n激发态，其对应的更高频率的红外吸收峰，称之为二倍频，三倍频。。。n倍频，这些振动频率统称倍频。合频，则是由于两个不同的基频振动同时跃迁而产生的，其吸收频率往往等于单个基频频率之和。绝大多数的物质的基频吸收都在500‐4000cm^‐1的中红外区域。基频吸收的特点是吸收强度很大，频率较固定，这导致了中红外光谱很适合定性分析物质结构，以及进行微量物质的分析，但相应的缺点就是中红外光谱受杂质影响非常大，因为即使微量的杂质也会在光谱上产生强烈吸收从而严重影响结果，因此中红外光谱必须要加入溴化钾作为稀释剂减轻杂峰的干扰，而且不能测量含水的物质。而多数物质的倍频与合频，落在波数4000‐14000cm^‐1的近红外波段，其吸收强度相对于基频吸收要弱1‐3个数量级。因此近红外光谱的缺点就是检测限高，只适合测量常量物质。同时基频和泛频的特征使得近红外光谱具有信息叠加严重，共线性的缺陷，不能直接使用，必须使用多元统计学的方法提取有效信息。近红外的优点，由于合频与倍频的吸收强度很弱，因此杂质峰的干扰也大大减弱，这使得近红外测量可以避免对样品进行复杂的预处理，而且可以对含水物质进行测量。因此，如何采用红外光谱对发酵液中的聚苹果酸含量进行有效测定是目前需要解决的技术问题。

发明内容