[发明专利]抗VWF蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.15594)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体OTI9F3。本发明还涉及单克隆抗体OTI9F3在制备用于检测VWF蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体OTI9F3的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体OTI9F3在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与VWF蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了VWF蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合VWF蛋白的单克隆抗体OTI9F3、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

VWF即血管性血友病因子，是一种多聚血浆糖蛋白，可以结合血小板糖蛋白Ib、糖蛋白IIb/IIIa、胶原蛋白及肝素，介导血小板对血管损伤位点的粘附。VWF主要由内皮细胞和巨核细胞合成，存在于血浆、血小板中α-颗粒及内皮细胞中的棒管状小体中。VWF对于止血与血栓形成非常重要，VWF结构和修饰的遗传缺陷会导致血管性血友病(VWD)，这是人体中最常见的先天性出血性疾病。或者说VWF水平升高表明与急性冠状动脉血栓形成有关，可作为动脉粥样硬化的一个临床风险标记物。

VWF是鉴定肿瘤内皮细胞(或巨核细胞)最有用的标志物之一。研究表明，VWF可作为许多白细胞亚群的黏附位点在炎症中发挥作用。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对VWF蛋白的单克隆抗体对IHC检测VWF表达水平具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的VWF蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测VWF蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为CGMCC No.15594。

本发明还提供了一种特异性结合VWF蛋白的单克隆抗体OTI9F3，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据VWF ORF核苷酸序列(VWF ORF核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，8442bp；VWF氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增VWF ORF第2292bp位到第3789bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pFASTbac-C-DDK，构建VWF重组表达质粒pFASTbac-DDK-rVWF。

(2)VWF重组蛋白的表达与纯化：将VWF重组表达质粒转染SF9细胞，获得的培养上清加入SF9细胞，然后裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的VWF重组蛋白。

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的VWF重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗VWF特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为OTI9F3，亚型鉴定为IgG2b；通过收集腹水制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得VWF单克隆抗体OTI9F3。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体OTI9F3在制备用于检测VWF蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体OTI9F3，可检测组织细胞中VWF的表达状况。