[发明专利]细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的一系列新应用。本发明以细粒棘球绦虫线粒体ND6基因为分子诊断标记，通过PCR检测屠宰动物是否感染细粒棘球蚴，具有很高的可靠性、特异性和灵敏性，同时借助直接PCR可提高检测效率，特别适合大规模基因检测及高通量分析。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的应用。

背景技术

细粒棘球绦虫的中绦期幼虫(细粒棘球蚴)主要寄生于人和动物(牛、羊、猪等)的肝脏和肺脏，引起人和动物的细粒棘球蚴病(又称包虫病)。细粒棘球蚴病为一种人畜共患寄生虫病，呈世界性分布，中国属包虫病高发地区之一。该病已造成严重的全球性经济问题和公共卫生问题。据估计，全球人囊性棘球蚴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年(DALYs)，而动物囊性棘球蚴病每年成的经济损失至少为20亿美元，其中对中国畜牧业的损失甚至达到了16亿元。因此，世界卫生组织(WHO)已将其列为被忽视的17种热带传染病和人兽共患病之一。

对携带细粒棘球蚴的动物内脏进行检测是包虫病防控的一个重要环节。目前多采用记录屠宰场宰后动物感染情况的方式对家畜棘球蚴病进行监测。然而，屠宰场通常只靠肉眼观察的方式进行判断，并不经过组织学鉴定，判断错误率可高达15.4％。同时，由于同属带科绦虫，细粒棘球蚴从肉眼上也易与寄生于相同中间宿主的其他带科绦虫相混淆(细颈囊尾蚴、羊囊尾蚴、牛囊尾蚴、猪囊尾蚴及亚洲带绦虫囊尾蚴)。因此建立一种可靠快速的检测方法是十分必要的。

随着分子生物学技术的发展，PCR检测技术因其快速、准确、敏感、特异等优点已经越来越多地应用于临床检测。近年来一种名为“直接PCR”的技术在“常规PCR”技术的基础上应运而生，直接PCR可将样品DNA的获取及PCR反应结合为一步，不仅节约操作时间，而且避免了对样品浪费。该技术已被应用于许多的寄生物种，如蠕虫、原生动物等。虽然PCR技术由于具有较高的敏感性、特异性等特点被广泛地应用于临床检测，但是如何选择合适可靠的分子诊断标记对动物疾病的检测是十分重要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫线粒体ND6基因的新应用，使得所述ND6基因作为检测细粒棘球蚴的分子诊断标记时，具备较高的准确度、灵敏度和特异性，并可较早的检出细粒棘球蚴。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

细粒棘球绦虫线粒体ND6基因作为检测细粒棘球蚴的分子诊断标记的应用；

细粒棘球绦虫线粒体ND6基因(ND6)全序列长度短(456bp)，结构简单无内含子，进化速率适中，序列变异丰富，突变率显著高于核DNA，目前已被广泛应用于牦牛、鱼类及昆虫的种群遗传结构分析，但是尚未报道用于屠宰家畜(牛、羊、猪)感染细粒棘球蚴的检测中。本发明利用PCR技术，将从线粒体基因组中筛选出的ND6全基因序列作为分子诊断标记并对该基因进行扩增，建立了一种检测屠宰家畜(牛、羊、猪)细粒棘球蚴的PCR方法。

由于同属带科绦虫，细粒棘球蚴从肉眼上也易与寄生于相同中间宿主的其他带科绦虫相混淆(细颈囊尾蚴、羊囊尾蚴、牛囊尾蚴、猪囊尾蚴及亚洲带绦虫囊尾蚴)。本发明以ND6基因为分子诊断标记分别对细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴、亚洲牛带绦虫囊尾蚴、脑多头蚴、牛囊尾蚴包囊进行了PCR检测，结果表明除细粒棘球蚴外均未扩增出目的条带，说明以ND6基因为分子诊断标记具有高度的种特异性，不会发生交叉反应。

在测定以ND6基因为分子诊断标记的灵敏度时，将目的基因按比例稀释(200ng-4pg)，结果表明随着DNA浓度的逐渐降低，目的条带亮度也在逐渐减弱直到稀释至4pg时阳性条带才完全消失。这表明以ND6基因为分子诊断标记具有较高的灵敏度，即使是小的包虫囊肿也可以通过直接快速PCR方法检测到。

基于ND6基因为分子诊断标记的多种优异效果，本发明还提出了如下多方面的新应用：