[发明专利]检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种检测布鲁氏菌抗体的电化学免疫传感器的制备方法，属于电化学生物传感器技术领域。该方法包括：将玻碳电极预处理，通过电沉积的方法将金纳米粒子修饰到玻碳电极上，然后引入谷胱甘肽做为抗污材料，与金表面自组装，再使HA通过N‑(3‑二甲基氨基丙基)‑N'‑乙基碳化二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺有效地缀合到谷胱甘肽上，最后用赤藓糖醇封闭非特异性活性位点。本发明解决了现有布鲁氏菌病检测方法的准确性差、处理过程复杂等问题。本发明免疫传感器的电极界面具有优异的亲水性，复合界面的防污性能明显提高，具有超高灵敏度，较宽的线性范围和较低的检测限，且稳定性和重复性能好，操作简便；可应用于复杂生物样品中布鲁氏菌病抗体的检测。

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法及其应用。

背景技术

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性球菌，由它导致的布鲁氏菌病是最常见的人畜共患病之一。这种疾病的最大特点是如果发现的早，并用正规方法治疗，超过90％的患者将被治愈，且终生不会复发，否则它将变成慢性疾病并且终生不可治愈。因此，该病的早期诊断尤为重要。

检测布鲁氏菌病的典型方法有虎红平板凝集试验(RBPT)，聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，环介导等温扩增技术(LAMP)和免疫层析试验。其中，RBPT方法操作简单且成本低廉最受欢迎，但假阳性率高，从而影响了它的广泛应用。对于其他方法来说，由于预处理过程复杂、对操作人员要求高，且需借助昂贵的仪器，因此限制了它们的普及。

电化学传感器由于无需标记、灵敏性高，选择性高，使用简单，检测快速以及所用仪器价格低廉等诸多特点，已经成为疾病检测的有效手段之一，但到目前为止关于成功运用电化学传感器检测布鲁氏菌病的文献报道很少。通常来说，性能优良的电化学传感器的制备跟电极修饰材料的导电性、生物相容性和抗污性密切相关，它们是影响检测灵敏度、准确度和稳定性的三个关键参数。本方案通过电沉积的方法将金纳米粒子(AuNPs)修饰到玻碳电极(GCE)上，有效提高了电极的导电性，然后引入谷胱甘肽(GSH)做为抗污材料，与金纳米粒子自组装。由于该材料富含氨基和羧基，因此赋予界面以优异的生物相容性。此外，GSH呈电中性并含有大量的酰胺键使得该界面同时具有较好的防污性能。只是在实际使用中，申请人发现血、尿和奶样品中含有大量的无机化合物、有机化合物以及各种生物大分子，而单一材料修饰的玻碳电极要想实现在复杂生物系统中高灵敏和高选择性地检测布鲁氏菌抗体是有难度的。因此将透明质酸(HA)与GSH复合形成一种新的复合抗污染界面，该界面除了保持良好生物相容性之外，其亲水性及抗污染特性都比没掺杂HA时效果要好，并实现了在1％稀释的血清中高灵敏和高选择性地测试布鲁氏菌抗体(BrAb)的目标，且该传感器还展现了较宽的检测范围，低的检测限和优良的稳定性和重现性。

本申请人发现了一种新的解决方案，在复杂的生物系统中直接检测布鲁氏菌抗体，电极界面受实际生物样品中的无机和有机化合物以及生物大分子的干扰较小，HA与GSH复合修饰的电极界面防污性能明显提高，且传感器的响应范围宽，最低检出限低于目前大多数布鲁氏菌病检测方法，实用性能强，具有良好的临床应用前景。

发明内容

针对现有布鲁氏菌病检测方法的准确性差、处理过程复杂，对操作人员的专业背景知识要求高等问题，本发明制备了一种电化学免疫传感器，能够检测复杂样品中的布鲁氏菌抗体，具有超高灵敏度，较宽的检出范围和较低的检测限；其制备方法相对简单，操作简便，适于批量生产。并且也填补了目前缺乏有效的检测布鲁氏菌病的电化学传感器的空白。

一种检测布鲁氏菌病的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将GCE进行预处理；

(2)将预处理好的GCE在HAuCl₄溶液中电沉积，然后用超纯水洗涤，氮气干燥，得到AuNPs/GCE；