[发明专利]一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒

说明书

本发明涉及一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒，属于鱼类生物技术领域，所述microRNA性别标签为dre‑miR‑10d‑5p，序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG；以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼在生殖遗传差异的区分问题。本标志miRNAs具有在雄鱼和伪雄鱼中显著差异表达的特点，是特异的分子识别标记。

技术领域

本发明属于鱼类生物技术领域，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域，具体地为一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒。

背景技术

半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大，无论是自然界还是养殖环境都不同程度的存在着伪雄鱼。伪雄鱼的染色体是ZW型，而它的生殖器官则和雄鱼一样，也可以产生精子且繁育后代。伪雄鱼还可通过遗传逐代积累，就导致了半滑舌鳎雌雄比例的失衡。因此开发鉴别半滑舌鳎伪雄鱼的方法不仅具有理论意义，而且也具有生产价值和市场价值。

鱼类性别鉴定有多种方法：生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞观察、雌性特异分子标记等。有些方法虽然简单易行，但是结果可能不准确，有些方法则需要剖杀鱼。外泌体内含物microRNAs，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，具有生物标签的特性，对于鱼类性别鉴定的具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题，提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体microRNAs作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。

本发明是采取以下技术方案实现的：

半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用，microRNA性别标签为dre-miR-10d-5p，其序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG。

本发明还提供一种所述microRNA性别标签的筛选方法如下：

1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallRNA进行测序分析，将clean reads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库对测序结果中的smallRNA进行分类注释；将分类注释后的序列和miRBase数据库比对，进行已知microRNA的统计；使用未注释上的序列进行新的microRNA预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物；

2)将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10；(4)foldChange值大于4，所述foldChange值＝TPM_{Sample_ZZ}./TPM_{Sample_ZW}；最终筛到了23个micro RNA作为候选标签进行验证。

3)提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA，利用Micro RNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的microRNAs的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-miR-10d-5p，序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。依据MicroRNA定量分析结果，进行雄鱼和伪雄鱼的判定。