[发明专利]一种制备LPOR蛋白晶体的方法

说明书

本发明公开了一种制备LPOR蛋白晶体的方法，具体包括LPOR蛋白表达、LPOR蛋白纯化、TEV酶切、Ni亲和层析、分子筛和结晶过程。本发明提供了一种结晶LPOR蛋白的方法，从而达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的，为其他光敏感超速蛋白的结构解析奠定了基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种制备LPOR蛋白晶体的方法。

背景技术

LPOR(light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase)是蓝细菌、藻类和多细胞植物叶绿素合成的关键酶。在光合作用途径中，生物体催化原叶绿素酸酯Pchlide还原有2种不同的还原酶：一种是依赖光的LPOR(light-dependent NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase)；另一种是不依赖光的Pchlide氧化还原酶DPOR(light-independent Pchlide reductase)。LPOR或DPOR作为原叶绿素酸脂还原催化酶，是光合营养生物中叶绿素合成的关键酶，这两个酶均广泛存在于光营养生物中，但是，DPOR与LPOR在分子结构、亚基组成、基因组编码和催化反应机制等方面完全不一样。DPOR是由叶绿体基因组编码，由3个蛋白质亚基组成；LPOR是由细胞核基因组编码；其中DPOR和LPOR的功能相似，均能够催化Pchlide D环双键的还原。其中，无氧光合细菌只有DPOR；裸子植物、藻类、蓝细菌和光合细菌具有DPOR和LPOR；被子植物只有LPOR。近十年里，在LPOR的调控、功能和催化机制等方面的研究取得了较大的进展，但是由于一直没有揭开LPOR三维结构的神秘面纱，对彻底阐明和确定LPOR的催化机理或将其工程化构成了一种无法逾越的屏障，多年来，科学家们试图用电脑模拟的手段来为生化学家提供线索，然而这些都只是推测，而对LPOR蛋白结构解析的难点，则是LPOR蛋白的纯化和结晶过程。

蛋白质提纯技术应用广泛，以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，而研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于相同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。虽然蛋白质的纯化技术已经非常成熟，但是对于一些极度不稳定的光敏蛋白，还是目前蛋白提纯研究的难点。

因此，提供一种制备LPOR蛋白晶体的方法，从而达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种制备LPOR蛋白晶体的方法，从而得到LPOR蛋白晶体，达到了对LPOR蛋白的结构进行解析的目的，为其他光敏感超速蛋白的结构解析奠定了基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备LPOR蛋白晶体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)LPOR蛋白表达

将质粒pEBSRC-TEV-LPOR转入宿主细胞中，挑取单克隆进行筛选和接种，培养3-6h后，加入IPTG诱导过夜，后离心收集菌体，并利用bufferⅠ悬浮菌体；

(2)LPOR蛋白纯化