[发明专利]一种优化LPOR蛋白结晶的方法

说明书

本发明公开了一种优化LPOR蛋白结晶的方法，具体包括LPOR蛋白表达、LPOR蛋白纯化、TEV酶切、Ni亲和层析、分子筛和结晶过程。本发明提供了一种优化结晶LPOR蛋白的方法，从而提高LPOR蛋白晶体的质量，优化LPOR蛋白晶体的衍射率，达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的，为其他光敏感超速蛋白的结构解析奠定了基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种优化LPOR蛋白结晶的方法。

背景技术

LPOR(light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase)作为蓝细菌、藻类和多细胞植物叶绿素合成的关键酶。LPOR酶的活性及基因表达直接影响黄化幼苗的转绿能力，对绿色植物的生长发育至关重要。但是，至今为止，科学家们并没有揭开LPOR蛋白结构的神秘面纱，对LPOR蛋白的作用机理也只是处于理论推测阶段。LPOR蛋白的结构及作用机理对光合作用的理论和应用研究意义重大，是诚待解决的重大科学命题。

虽然结构生物学家已经从生物学和物理学等各个角度努力提高蛋白质的筛选成功率，且取得了显著进展，但是，目前蛋白质结晶条件的筛选研究仍旧具有很大的难度和挑战性。在蛋白质可结晶性的研究中，多数的研究只是针对几种常用的“明星蛋白质”进行，所以当用这些技术筛选其它蛋白质结晶条件时，缺乏普遍的适用性。因此，针对特定蛋白质，设计特定的蛋白结晶筛选策略，已成为晶体筛选的必然过程，尤其是对于光敏感蛋白的结晶，更是需要针对蛋白理化性质设计独特的筛选过程。

因此，提供一种优化LPOR蛋白结晶的方法从而提高LPOR蛋白晶体的质量，优化LPOR蛋白晶体的衍射率，达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种优化LPOR蛋白结晶的方法，从而提高LPOR蛋白晶体的质量，优化LPOR蛋白晶体的衍射率，达到对LPOR蛋白的结构进行解析的目的，为其他光敏感超速蛋白的结构解析奠定了基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种优化LPOR蛋白结晶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)LPOR蛋白表达

将质粒pEBSRC-TEV-LPOR转入宿主细胞中，挑取单克隆进行筛选和接种，培养3-6h后，加入IPTG诱导过夜，后离心收集菌体，并利用bufferⅠ悬浮菌体；

(2)LPOR蛋白纯化

将步骤(1)中得到的菌体悬浮液进行破碎，离心后得上清液，并将上清液经Ni亲和层析柱，并用bufferⅠ平衡纯化柱，之后分别用bufferⅡ、bufferⅢ和bufferⅣ冲洗纯化柱，并将每一个洗脱下来的蛋白峰分别收集，以待SDS-PAGE验证；其中LPOR被bufferⅢ洗脱，收集bufferⅢ洗脱蛋白；

(3)TEV酶切

将步骤(2)中得到的蛋白进行酶切除去His标签，并利用SDS-PAGE检验酶切效率；

(4)Ni亲和层析

将步骤(3)中得到的酶切后的蛋白液进行离心除去沉淀，过滤后进行上样，并收集流穿中的蛋白；

(5)分子筛

将步骤(4)中得到的蛋白进行浓缩后上样，利用GF buffer冲柱，并分别收集每一个蛋白峰，以待SDS-PAGE验证；

(6)蛋白浓缩结晶