[发明专利]乙肝病毒肝内整合状况的感染者外周血检测方法

说明书

本发明提供了乙肝病毒整合状况的检测方法，该方法以外周血中的游离DNA作为样品进行检测。所述方法能够避免手术活检、穿刺活检等传统方法的并发症风险，提高安全性，可以实现更高频繁的定期监测，而且避免了组织取样的异质性偏差。本发明的方法特异性好、灵敏度高，可以在100％的HBV感染后肝癌患者的外周血样本中检测到，最低可以在5ml外周血血浆提取到的全部cfDNA中检测到片段。

技术领域

本发明涉及乙肝病毒整合状况的检测，特别涉及外周血游离DNA在乙肝病毒整合状况检测中的应用。

背景技术

乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)作为逆转录病毒，具有整合入宿主基因组的能力，最早在20世纪八十年代早期就被报道，在肝癌基因组中的研究也有很多积累^1-13。HBV的整合能力并不是其生活史(Life Cycle)以及感染宿主所必须，肝病毒基因组中目前不认为存在基因编码有整合酶活性的病毒蛋白¹⁴，早期的研究曾认为HBV整合事件是在全基因组随机分布的罕见事件¹⁵。HBV整合机制的研究认为，病毒整合入宿主基因时的主要形式是线性双链DNA(double strand linear DNA，dsL DNA)¹⁶，是cccDNA形成过程中的中间体，而cccDNA是HBV感染慢性化中最关键的一环¹⁷，因而推断整合事件可以伴随着HBV慢性感染的全过程。虽然研究人员不断尝试构建可以用于HBV生活史研究的细胞、动物模型，但一直以来尚未有成熟体系¹⁸，对cccDNA相关的生物学过程研究基于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)，包括目前估计的10³～10⁴个感染的细胞中会发生一次整合也是基于DHBV感染实验¹⁶。最早研究者曾认为整合入宿主基因组中的病毒片段处于失活(Defective)状态无法产生蛋白，后续研究提示整合频率最高的HBV基因组片段为DR2-DR1区域以及preS/S基因区域¹⁹，会分别翻译产生截短型的X蛋白、表面蛋白²⁰，并通过各自特定机制诱发肝细胞向肿瘤细胞转变^21,22，因而此类现象也被认为属于整合事件在肝脏病程进展中的反式(Trans)作用。最新研究报道，整合的片段与邻近的基因可产生嵌合转录本(Chimeric Transcripts)，如HBV-MLL4²³、HBV-cyclin A2²⁴；Chiu YT等人提出存在pre-mRNA splicing机制，使其可以翻译出无法被宿主细胞降解的病毒-人嵌合蛋白，导致细胞周期进程加快²⁴。近年来更是认为慢性感染中整合的病毒DNA片段也会继续在受累的人肝脏细胞中翻译产生病毒的蛋白质影响一系列细胞的功能活动以及宿主的免疫反应^25,26。