[发明专利]一种LPOR蛋白的表达纯化方法

权利要求书

1.一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)筛选LPOR基因的DNA序列

根据genebank中公布的LPOR蛋白的核苷酸序列NC_004113设计引物，并在所述引物两端加入BspHI/BamHI酶切位点，从所述NC_004113序列中筛选LPOR基因的DNA序列为SEQ IDNO 3，并选择原核表达载体；

其中所述引物序列为

LPORN：5’-TCATGAATGAGTGATCAGCCACG-3’；SEQ ID NO 1；

LPORC：5’-GGATCCGGCCAATCCCACCAGTTTTTC-3’；SEQ ID NO 2；

(2)将步骤(1)得到的LPOR基因的所述DNA序列进行PCR扩增；

(3)双酶切

将步骤(2)得到的PCR产物纯化后分别用BspHI/BamHI双酶切，同时将所述原核表达载体用BspHI/BamHI双酶切，回收酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段；

(4)LPOR表达载体构建

将步骤(3)得到酶切后的PCR产物和原核表达载体大片段，按10:1-5:5的比例混合连接，并将得到的连接产物转入感受态细胞中，得到LPOR表达载体；

(5)LPOR表达载体的筛选

将步骤(4)得到的所述LPOR表达载体挑取在筛选平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，提取质粒，酶切验证正确后测序确认；将测序结果正确的LPOR表达载体保存备用。

(6)LPOR蛋白表达

将步骤(5)中构建好的LPOR表达载体转入原核表达菌株中，在25-37℃下培养24-48h，加入诱导剂表达LPOR蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述原核表达载体为pEHISTEV、pBADHISTEV1、pEBMSCHIS或pEBSRCTEVC10HIS中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(4)中所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

4.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(5)中所述筛选平板培养基为含有50-150mg/L的卡那霉素或氨苄霉素抗性的培养基。

5.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(6)中所述原核表达菌株为大肠杆菌C43、大肠杆菌BL21或194菌株。

6.根据权利要求1所述的一种LPOR蛋白的表达方法，其特征在于，步骤(6)中所述诱导剂为0.1-1.0mM的IPTG或质量浓度为0.01-0.05％的L-Arabinose。

7.一种LPOR蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)His-tag亲和层析

将权利要求1步骤(6)中经过诱导剂诱导的菌液离心，收集菌体细胞并利用清洗液清洗，再用平衡液漂洗，最后用35mL/g的平衡液重悬，将收集好的菌液超声破碎，离心后取上清液，后真空过滤，再进行His-tag亲和层析；

(2)蛋白浓缩

将步骤(1)得到的蛋白加入超滤杯中，3000-5000rpm，离心，直至达到所需体积后停止离心，并测定蛋白浓度；

(3)凝胶过滤

将步骤(2)得到的浓缩蛋白加入0.5uM NADPH辅酶后进行凝胶过滤层析，收集蛋白样品，将所述蛋白样品进行sds-page分析，得到单一目标条带的蛋白样品，再利用所述超滤杯浓缩蛋白样品至浓度为10-15mg/ml。

8.根据权利要求7所述的一种LPOR蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述真空过滤为选用0.45μm的滤膜进行过滤。

9.根据权利要求7所述的一种LPOR蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述超滤杯为30kd超滤杯。

10.根据权利要求7所述的一种LPOR蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶过滤层析选用sephadexg-75凝胶层析柱。