[发明专利]核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向

说明书

本申请提供了通过使用同源重组在基因组的靶基因座制备一种或多种经靶向的基因修饰的组合物和方法，其中通过在所述靶基因组的基因座或其附近的单链或双链的断裂促进所述同源重组。本申请还提供了使用工程改造的核酸酶在原核或真核细胞中提高LTVEC和基因组的靶基因座之间同源重组效率的组合物和方法。

本申请为申请日为2013年4月25日，申请号为201380030738.6，标题为“核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向”的中国发明专利申请的分案申请，其全部内容均通过引用并入本申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638,267的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

发明领域

核酸酶和DNA构建体包括靶向载体(例如，大靶向载体，“LTVEC”)以用于实现在基因组的靶基因座的同源重组。本申请提供了通过使用同源重组制备经靶向的基因修饰的组合物和方法，其中通过在基因组的靶基因座或其附近的单链或双链断裂促进所述同源重组。本申请提供了使用工程改造的核酸酶在原核或真核细胞中提高LTVEC和基因组的靶基因座之间同源重组效率的组合物和方法。

背景技术

使用靶向载体的同源重组是一种在非人动物中获得所需基因组修饰的流行方法，所述靶向载体被特别设计以便在基因组的基因座加入、缺失或取代特定的核酸序列。被特异性工程改造以便在基因组的靶基因座或其附近引入单链或双链断裂的核酸酶能够与靶向载体一起使用以提高在基因组的靶基因座同源重组的效率。

尽管通过同源重组进行基因组修饰的技术在最近二十年中已经相当先进，但是在很多情况下使用非常大的靶向载体LTVEC达到可接受的靶向频率仍存在困难，例如当使用较多的人源基因组片段取代较大部分的啮齿动物基因组时，或者靶向某些细胞类型时存在困难，例如成纤维细胞或其他体细胞。在本领域中需要用于使用LTVEC修饰真核基因组的较大基因组基因座的更多的和改进的方法。

发明概述

本申请提供了使用大靶向载体(LTVEC)联合核酸酶试剂修饰基因组中感兴趣的基因座的组合物和方法，所述组合物和方法使得在基因组中感兴趣的基因座上能够有效进行较大的核酸序列的缺失、加入(例如插入)和/或取代。

本申请提供了使用LTVEC和核酸酶试剂通过细菌同源重组(BHR)在原核细胞中修饰哺乳动物基因组的靶基因座的组合物和方法，其中通过所述核酸酶试剂在基因组的靶基因座或其附近产生的单链或双链断裂促进所述BHR。本申请提供了包含LTVEC和核酸酶试剂的原核细胞，所述核酸酶试剂在表达后能够在靶位点或其附近引入单链或双链断裂。本申请提供了用于通过使用本申请所述的各种LTVEC和核酸酶在发生重组的原核细胞中使用外源性的核酸序列(例如，同源的或直系同源的人源基因组核酸序列)取代非人动物较大的基因组基因座的组合物和方法。

本申请提供了在各种多能性哺乳动物细胞中使用LTVEC和核酸酶试剂修饰基因组中感兴趣的基因座的组合物和方法。本申请提供了用于通过使用本申请所述的各种LTVEC和核酸酶在非人动物的多能细胞中使用外源性的核酸序列(例如，同源的或直系同源的人源基因组核酸序列)取代非人动物较大的基因组基因座的组合物和方法。

本申请提供了非人动物的多能细胞，所述细胞包含本申请所述的各种LTVEC和核酸酶试剂。

本申请提供了用于生成经基因修饰的非人动物的组合物和方法，所述经基因修饰的非人动物包含如本申请所述的一个或多个经靶向的基因修饰。

在一个方面，本申请提供了一种原核细胞，所述原核细胞包含大靶向载体(LTVEC)，所述载体包含定向至靶基因座的同源臂，和编码核酸酶试剂的核酸序列，所述核酸酶试剂在所述靶基因座或其附近形成单链或双链断裂。