[发明专利]一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法

说明书

本发明涉及一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法,本发明将靶向多肽基因转染真核细胞，并将靶向多肽展示到细胞膜上，获得稳定表达靶向多肽的基因工程改造细胞株后，利用该细胞株提取尺寸均一的纳米级细胞膜囊泡，再将溶瘤病毒(OV)装载到工程改造的细胞膜囊泡里，合成可静脉注射同时靶向肿瘤递送的溶瘤病毒复合体。本发明将溶瘤病毒装载在细胞膜囊泡里面，能够有效降低机体里中和抗体对溶瘤病毒的中和作用，同时细胞膜囊泡经过基因工程改造后具有靶向性，能够实现溶瘤病毒的靶向递送和在肿瘤部位的富集，同时降低溶瘤病毒的全身性副作用。

技术领域

本发明涉及一种可静脉注射的溶瘤病毒疫苗的制备方法。

背景技术

溶瘤病毒疗法是一种治疗癌症的理想治疗方法，利用病毒能够选择性的在肿瘤细胞复制扩增的特性，溶瘤病毒疫苗在多项临床前和临床试验中都取得了良好的治疗效果。最近，美国FDA批准了安进公司的溶瘤病毒疫苗(T-VEC)用于皮肤和淋巴结黑色素瘤病变的治疗。此外，几项人体临床试验报告中也报道了在局部癌症基因治疗中使用溶瘤病毒的情况。然而，当溶瘤病毒直接进入机体的血液循环系统时，会引起机体固有的抗病毒免疫和先天免疫反应，以及溶瘤病毒容易在组织器官发生非特异性隔离等因素，使得传统溶瘤病毒疫苗无法通过静脉注射的方式进入机体，这对癌症病毒疗法的发展构成了重大的障碍。因此，迫切需要发展全新的溶瘤病毒递送系统来解决上述问题。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，其包括如下步骤：将靶向肿瘤细胞的多肽基因转染真核细胞，并将该多肽基因对应的靶向多肽展示到真核细胞的细胞膜上，获得稳定表达靶向多肽的基因工程改造细胞株；然后利用该细胞株提取尺寸均一的纳米级细胞膜囊泡，再将溶瘤病毒装载到该纳米级细胞膜囊泡里，得到可静脉注射的溶瘤病毒复合体。

优选地，多肽基因包括PreS1、GPC3、HA、VEGF、PD-1/PD-L1、Trail中的至少一种。

优选地，多肽基因转染真核细胞的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染方法中的至少一种。

优选地，溶瘤病毒的种类包括溶瘤腺病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、新城病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、呼肠病毒、逆转录病毒中的至少一种。

优选地，将溶瘤病毒装载进细胞膜囊泡的方法包括脂质体挤压法、电转法、超声法、冻融法、皂化法中的至少一种。

优选地，真核细胞，包括MDCK细胞、VERO细胞、S2细胞、昆虫细胞、胚胎干细胞、患者自体分离培养的细胞中的至少一种。

优选地，所述的静脉注射的溶瘤病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)通过基因转染的方法，将靶向多肽基因转入真核细胞中，并通过靶向多肽基因中的信号肽将靶向多肽表达到细胞质膜上；

2)转染24h后，使用500～550μg/ml的G418，对转染的真核细胞进行筛选，每3～5天更换一次筛选培养基；筛选，至有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大；

3)挑取克隆团簇的细胞，胰酶消化后，将细胞通过有限稀释法接种到细胞培养皿中，加入200～250μg/ml的G418对细胞维持筛选；

4)待单克隆细胞增大后，将其扩大培养，并重复步骤(3)的有限稀释法进一步筛选稳定表达细胞株，经过多代的筛选获得能够稳定表达靶向多肽的细胞株；

5)取稳转细胞株进行扩大培养，挑选生长对数期的细胞，PBS洗涤3～5次之后，加入含有PMSF蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，充分浸润细胞；

6)将细胞收集起来，充分震荡细胞使其均匀分散，将细胞悬液置于1-5℃下旋转混悬，使细胞充分破裂形成大量细胞膜囊泡；