[发明专利]一种猪小有腔的卵丘卵母细胞复合体的收集方法

说明书

本发明公开了一种猪小有腔的卵丘卵母细胞复合体的收集方法，以猪的卵巢为原材料，通过卵巢采集、器材消毒、卵泡吸取、卵母细胞收集等步骤，收集卵母细胞的效果最佳，回收效率最高，能够充分利用手中现有的资源，简单、经济、高效的回收猪小有腔卵泡的卵泡液以及卵丘卵母细胞复合体，对于今后有关于猪小有腔卵泡中的卵母细胞发育的研究以及畜牧业的发展提供了丰富的材料。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体为一种猪小有腔的卵丘卵母细胞复合体的收集方法。

技术背景

现如今，随着动物胚胎工程技术快速发展的同时，也极大的促进了畜牧业、养殖业以及生物医学的进步。利用动物胚胎功能工程技术可以改良家畜品种、培育转基因新品种、制备人类疾病模型、生产药用蛋白、研究胚胎发育机理等。而猪是胚胎生物学家和遗传学家研究的重要的模式动物之一，因为猪的生理和解剖结构与人类有很大的相似之处。

目前，如何在猪卵巢中简单、高效的收集卵母细胞是开展后续体外成熟技术(IVM)、体外受精技术(IVF)、体细胞克隆技术(SCNT)、孤雌激活(PA)等现代动物胚胎生物技术必不可少的环节也是支持上述技术必不可少的保障，尤其是关于猪小有腔卵泡液以及卵泡液中卵丘卵母细胞复合体的收集则十分困难，因此发明一种简单、经济、方便、高效的卵母细胞收集方法就显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种猪小有腔的卵丘卵母细胞复合体的收集方法，简单、经济、方便、高效，收集卵母细胞的效果佳，回收效率高，为今后有关于猪小有腔卵泡中的卵母细胞发育的研究以及畜牧业的发展提供了丰富的材料。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪小有腔的卵丘卵母细胞复合体的收集方法，包括以下步骤：

S1：卵巢采集：从屠宰场选取猪的卵巢，并将卵巢存放于盛装有青霉素G和硫酸链霉素两种抗生素的生理盐水的保温杯中，且保温杯中温度保持在28～35℃，2h内带回实验室；

S2：器材消毒：在实验室中，将下一步骤所需用的器材全部进行消毒；

S3：卵泡吸取：采用5ml注射器针头配合5ml无菌注射器针筒抽吸卵巢上的0.5～2mm的卵泡，并将抽取的卵泡液和卵母细胞缓慢注入置于38℃恒温水浴锅的15ml尖底离心管中，使卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte complexes,COCs)自然沉降；

S4：卵母细胞收集：用洗卵液将上一步骤自然沉降的卵泡液和卵母细胞稀释到适宜浓度，再通过体式显微镜收集液体中的卵母细胞，从而完成猪小有腔卵泡中卵丘卵母细胞复合体的收集。

优选地，所述注射器针头为健士牌一次性无菌注射器针头。

优选地，所述S2步骤中进行消毒的器材，包括5ml注射器针头、 5ml无菌注射器针筒、15ml尖底离心管。

优选地，所述S4步骤中的洗卵液的制备方法为：首先用100 mL去离子水溶解1gPVA(Polyvinyl alcohol，Sigma)，待PVA完全溶解，冷却后再称取9.55g DPBS粉末(Dulbecco’s phosphate buffered saline，Gibco，758054，无钙镁)，加去离子水，使溶解、定容至1L，勿搅拌；然后高压前盖上锡箔纸，高压灭菌结束后冷却，以1mL/L的比例加酚红和双抗；最后在超净台内，使用0.22μm 滤器，除菌后分装至50mL离心管中，4℃保存，使用前38.5℃条件下预热。

优选地，所述S1步骤中的生理盐水，其制备方法包括以下步骤：

(1)、称取1.3g青霉素(P3032)与1g链霉素(S1277)于15mL 胚胎培养水中，充分溶解后定容至20mL，再使用0.22μm滤器过滤除菌，制备成浓度为1000×的母液，将母液分装到800μL的EP离心管中，每管分500μL，置于-20℃保存备用；