[发明专利]一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用。所述的外泌体制备方法采用重组表达外源目的蛋白的方法，包括蛋白的瞬时表达和稳定表达，通过工程化大规模培养细胞的手段，获得大量包含外源目的蛋白的外泌体。本发明的培养过程不需要添加血清，免除了外泌体提取过程中血清囊泡的污染；通过规模培养细胞来获取大量装载具有生物活性抗体的外泌体，为外泌体的产业化提供了可能性，具有良好的产业化前景。同时，通过本发明的制备方法所得到的外泌体包载了活性蛋白，可以更易于透过组织和细胞膜，以及血脑屏障，到达病灶部位用于肿瘤等疾病的治疗；也可以用于护肤品，更易于透过皮肤，应用广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用。

背景技术

传统药物，无论是化学药物还是中药，往往存在水溶性差、易被人体快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，而生物药物如蛋白质药物也存在易降解，不稳定的问题。因而人们研制了不同的药物投递系统以解决以上问题，例如脂质体等纳米颗粒。然而，这些化学合成的包载颗粒存在许多问题，其中最重要的一点是，可能会引起很强的免疫反应。

1981年，Trams等在透射电镜下发现了一组比多泡体还要小的、直径在40～1000nm的囊泡样物质。1987年，Johnstone等命名这种膜泡为外泌体(exosomes)，其产生的主要过程，可概括为：(1)细胞质膜凹陷形成细胞内小泡；(2)细胞内小泡进一步发展形成多泡小体；(3)多泡小体与细胞质膜融合释放外泌体，受体细胞对外泌体的接收可以通过配体-受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来实现。从其产生过程可以看出，外泌体是细胞膜成分的囊泡，内里可以携带诸如RNA，蛋白质等大量成分。这也使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药物包载系统的想法。

外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留 (EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。然而对于大分子蛋白质药物，用现在常用的电穿孔，转染，孵育等包载药物的手段则非常困难。

因此，如何高效地获得包载蛋白的外泌体亟待研究突破。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种包载蛋白的外泌体的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述的包载蛋白的外泌体的制备方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种包载蛋白的外泌体的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建含有外源目的蛋白基因片段的重组表达载体，

(2)将所述的重组表达载体转染细胞进行表达，培养转染后的细胞，使细胞分泌载有所述外源目标蛋白的外泌体；

①当所述的表达为瞬时表达时，具体步骤为：

A.细胞的培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4× 10⁵～6×10⁵个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO₂，转速160～200rpm 下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中细胞活率维持在 90％左右；

B.将所述的重组表达载体转染细胞，转染后的细胞在36～38℃，4～8％CO₂，转速160～200rpm下悬浮培养，当细胞活率低于30％终收样；

②当所述的表达为稳定表达时，具体步骤为：