[发明专利]一种靶向性外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种靶向性外泌体的制备方法及其应用，其中靶向性外泌体的制备方法：将PSP1多肽与任一种靶向肽或具有促进免疫功能的短肽共价结合形成PSP1靶向肽后，再与外泌体进行结合；所述PSP1多肽的氨基酸序列为：CLSYYPSYC或者与PSP1具有80％以上同源性的序列的多肽。本发明提供通过大量的测试和实验，首次提出了将PSP1多肽与靶向肽或具有促进免疫功能的短肽进行结合，形成双向靶向性的多肽再与外泌体进行结合，该方案克服了现有的质粒转染等表面修饰方法存在的转染效率低的问题，提高了外泌体表面的修饰效率，实现了靶向性外泌体的大规模制备，对于外泌体作为运输载体的研究和应用具有非常重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种靶向性外泌体的制备方法及其应用。

背景技术

RNA治疗技术，尤其是siRNA，反义寡核苷酸以及CRISPR-CAS9基因组编辑介导的RNAs属于新兴的可编程治疗技术，以高特异性和高度可变性为显著特征。然而由于低摄取效率和高细胞毒性目前大多数可编程RNA药物治疗方法不适合临床应用。因此，将RNA药物输送到大多数原发性组织和癌细胞，包括白血病细胞和实体瘤细胞的安全有效的策略仍然未得到有效开发(Usman et al.,2018)。

外泌体(Exosomes)是细胞经过内吞-融合-外排等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。

外泌体与哺乳动物细胞的天然生物相容性表明，它可以克服大多数细胞屏障和药物传递障碍，如核糖核酸酶敏感性、内体累积、吞噬作用、多药耐药性、细胞毒性和免疫原性(Usman et al.,2018)。理论上外泌体是未来RNA治疗技术的最理想载体，得到众多研究者的关注和开发。外泌体通过与细胞膜直接融合、与细胞膜表面特异性受体结合进而通过主动运输(内吞、脂筏等)进入细胞内。其中外泌体上的特异性蛋白与细胞表面的相应受体的特异性结合，是实现外泌体靶向运输的重要方式。

目前在RNA治疗技术中，对于外泌体的表面修饰的研究报道较少，已有的研究均为利用重组质粒将靶向短肽和外泌体表面膜蛋白在外泌体分泌细胞上进行重组表达，通过收集释放的外泌体，达到对外泌体的表面修饰。由于该方法存在质粒转染效率较低，特别是间充质干细胞或红细胞这两类最有应用前景的外泌体母细胞的质粒转染效率低，难以通过基因工程质粒转染进行大规模制备分泌母细胞。由于外泌体上表面膜蛋白是一个复合的三维结构，靶向短肽融合外泌体膜蛋白上进行表达，融合蛋白的三维结构折叠是一个非常复杂的系统性过程，因而靶向肽在融合蛋白上的表达构象难以有效确定。另外目前外泌体的分离一般采用经典的差速离心法，分离的效率较低。由于以上所述的原因，难以实现大规模靶向性外泌体的制备。因此，研发一种新型高效的外泌体表面修饰方法，对于外泌体作为运输载体的研究具有非常重要的意义。

发明内容

为解决上述背景技术中提到外泌体修饰效率低的问题，本发明提供一种靶向性外泌体的制备方法：

将PSP1多肽与靶向肽或具有促进免疫功能的短肽共价结合形成PSP1靶向肽后，再与外泌体进行结合，即获得具有靶向性外泌体。

进一步地，所述靶向肽至少包括EGFR靶向肽、nAchR靶向肽和肝癌细胞靶向肽中的一种。

进一步地，所述EGFR靶向肽为GE11多肽；

所述GE11多肽的氨基酸序列为：YHWYGYTPQNVI；