[发明专利]一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用，属于分子生物学领域。所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的重组心肌肌钙蛋白具有良好的稳定性，在42℃条件下放置1天的失活率为12％，显著低于常规市售人源血清来源的cTnI和现有技术公开的心肌肌钙蛋白。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

心肌肌钙蛋白(cTn)是心肌细胞收缩的调节蛋白，它由三种不同基因的亚基组成：原肌凝蛋白亚单位TnT(39kDa)、肌动球蛋白-ATP酶抑制亚单位TnI(26.5kDa)、钙结合亚单位TnC(18kDa)。cTnI的检测是三者中灵敏度最高的，因此检测要求精度也是最高的，常规手段在该项目的检测中很难做大很高的准确性和精准度。

cTnI具有非常重要的临床意义，主要表现在：(1)cTnI不受骨骼肌受损伤的影响，且在患者发病后出现较早，持续时间长，具有其独特的心肌特异性和诊断窗口期较长的优势，是目前诊断心肌损伤较好的确定标志物。(2)cTnI的释放与心肌梗死面积呈线性相关，AMI后9h相关性最好，AMI后9h cTnI的浓度可估计心肌梗死的面积。心肌梗死的面积与心室功能的减弱和室性心率失常的发生有密切的关系，估计心肌梗死的面积对后续病情评估预后有很大帮助。(3)cTnI对检测微小心肌损伤具有较高的敏感性和特异性，可用于心脏围手术期的监测，已有研究表明，cTnI对术后微小心肌损伤的预测价值最高。(4)cTnI具有唯一的心肌特异性，可鉴别骨骼肌损伤或慢性肾衰患者是否伴有心肌损伤。

因为cTnI具有非常重要的临床意义，所以在临床应用中也会出现多种对cTnI检测的平台，例如：临床生化检测、胶体金免疫层析检测、荧光免疫层析检测、化学发光检测等。但是无论哪种检测平台使用过程中，都必须要配套稳定性好、能够溯源的校准品和质控品，才能获得可靠准确的检测值。

SRM 2921作为目前唯一的国际标准物质，这是天然的cTnI-C-T的三重复合物。以SRM 2921为校准品，可使检测间有了一些溯源性，但是并没有任何生产厂商考虑使用该物质进行溯源，这是因为通过免疫学检测方法与抗-cTnI单克隆抗体一起对SRM 2921进行检测时，发现SRM 2921cTnI物质正在发生降解。除此之外，目前市场上存在的cTnI校准品和质控品都是通过临床血清处理后进行制备，众所周知血清成分复杂，含有大量酶类物质，会对cTnI产生降解反应，使其在短时间内浓度不断下降，再加之其获得方法不容易实现，以及法律法规对人源血制品的管控，都证明了其市场应用的限制性。

由于天然的cTnI不易获得，且容易降解，使cTnI的检测和溯源一直备受病垢，大量的研究人员也将重点转移至cTnI重组蛋白上，但是经过长时间的研究发现，单纯的cTnI基本上不会产生免疫反应，必须以复合物的形式存在才能发生免疫反应。2002年，Shi等人在专利US6475785B1中提供了制备重组cTnI-C复合物的方法，其能够产生免疫反应，但稳定性较差的问题。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明在专利US6475785B1的基础上，采用蛋白质定向进化技术-易错PCR技术对cTnI-C复合物进行改造，最终获得了稳定性提高且不降低活性的cTnI-C复合物突变体。

本发明提供了一种稳定的重组心肌肌钙蛋白，所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了编码上述重组心肌肌钙蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

本发明提供了用于扩增上述基因的引物对，所述引物对包括上游引物ICH-001和下游引物ICH-002；所述上游引物ICH-001的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述下游引物ICH-002的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

本发明提供了含有上述基因的重组载体。