[发明专利]利用CRISPR-Cas9构建的斑马鱼cip2a基因突变体及其构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用CRISPR‑Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体以及使用该方法构建的斑马鱼cip2a基因突变体。其中包括了cip2a基因座上Cas9‑gRNA靶位点的设计，Cas9mRNA和cip2a‑gRNA的合成，以及体内显微注射和后续遗传筛选。该靶位点的序列位于cip2a基因第二个外显子上；同时设计一对包含靶位点的引物，通过PCR进行靶位点突变的验证。该验证方式同样适用于后续遗传筛选。本发明所述的利用CRISPR‑Cas9技术构建的cip2a斑马鱼突变体表现出高突变率，且突变造成了Cip2a蛋白翻译的提前终止。此外，本发明所述的cip2a基因突变斑马鱼仅通过连续的两代筛选就得到了。本发明获得了2种突变类型的cip2a突变体斑马鱼系。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种利用CRISPR-Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法以及使用该方法构建的斑马鱼cip2a基因突变体。

背景技术

蛋白质磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A PP2A)是一种重要的肿瘤抑制因子，而抑制其表达可促进人类癌细胞的各种恶性特征。在癌症中，一组PP2A的阻遏蛋白抑制了PP2A的表达。其中，cip2a(Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A)是一种重要的PP2A内源癌性抑制剂，它由基因KIAA1524编码。cip2a能抑制细胞内蛋白磷酸酶PP2A对c-MYC蛋白的去磷酸化作用，从而稳定c-MYC蛋白表达水平，促进细胞转化和体内肿瘤的生长。还能通过抑制PP2A来激活几种关键的癌症驱动因子(Akt，MYC，E2F1等)的活性，并促进大多数癌症类型的恶性表型。此外，cip2a在许多肿瘤中都呈现出高水平的表达，而在多种良性组织细胞中表达量都很低。值得注意的是，在十几种不同癌症类型患者中，cip2a蛋白的高表达都预测了较低的生存率。因此，cip2a在癌症治疗的预后和功能相关性等方面有着重要的意义。

斑马鱼是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的模式生物，基于其快速迭代的优势，可以很好地用于癌症肿瘤学的研究。在斑马鱼中cip2a基因被称作蛋白磷酸酶2A细胞增殖调节抑制剂(cell proliferation regulating inhibitor of proteinphosphatase 2A，cip2a)。目前在斑马鱼中对于cip2a基因功能的研究仍是缺失的，本专利通过CRSPR-Cas9建立了斑马鱼cip2a的突变体，为进一步研究cip2a的功能提供了材料基础。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)，最早是由日本科学家Ishino在大肠杆菌中发现。Cas则指的是CRISPR相关蛋白，一般定位于CRISPR位点附近，是一个有多种亚型多肽的蛋白家族，而Cas9是应用最为广泛的一个亚型。2013年1月，Woong YHwang等首次将该技术应用于斑马鱼基因编辑中。通过外源导入靶向基因组的gRNA和Cas9mRNA，gRNA即可引导Cas9蛋白切割基因组靶点附近的DNA双链，进而引发细胞的错配修复，从而造成基因突变。

发明内容

本发明目的在于构建了斑马鱼cip2a基因的突变体。

为实现上述构建斑马鱼cip2a基因突变体的目的，本发明提供的技术方案是：

1.根据cip2a基因序列设计Cas9靶位点；

2.确认靶位点在斑马鱼基因组中的特异性；

3.显微共注射cip2a-gRNA和Cas9 mRNA到斑马鱼胚胎，并验证突变效率；

4.饲养F0胚胎至性成熟，和野生型外交，检测F1胚胎突变类型；