[发明专利]提高样品切片的扫描成像在Z轴方向上分辨率方法及系统

说明书

本发明公开了一种提高样品切片扫描图像在Z轴方向上的分辨率方法及系统，其方法包括：通过设置扫描电子显微镜的入射电子束电压，对样品切片进行不同入射能量的背散射电子成像，获得位于所述样品切片内的不同深度处的初始扫描图像；通过主成分分析方法对各所述初始扫描图像进行处理，获得与所述样品切片内的不同深度处相对应的优化扫描图像；分别对各所述优化扫描图像进行对比度调整和滤波处理，以提高所述样品切片的扫描图像质量、以及其在Z轴方向上分辨率。本发明针对样品切片在不改变电镜设备硬件条件的情况下，通过对样品切片内不同深度处的扫描成像并配合相应的图像处理方法，达到提高大尺度样品切片Z轴分辨率的目的。

技术领域

本发明属于电子显微成像技术领域，具体涉及一种提高样品切片扫描图像在Z轴方向上的分辨率系统。

背景技术

扫描电子显微镜中的背散射电子成像技术是一种利用电子光学系统对观测样品进行放大成像的技术，该技术已经成为目前观察亚显微尺度生物组织样品的不可或缺手段。目前，主流的扫描电子显微镜在其XY平面上的分辨率已经可以达到<5nm，因此，足以满足对生物大脑神经元这一类重要亚显微结构的观察与研究。然而，由于扫描电子显微镜成像的特点，其图像在Z轴方向上分辨率则取决于样品的切片厚度，而样品厚度则由样品技术所决定。

目前，主流的切片技术有如下几种，一是聚焦离子束切片技术(Focused Ion BeamScanning Electron Microscope,FIB-SEM)，基本原理是对感兴趣的微小区域，利用离子束对样品切片表面进行切割，其特点是切片厚度薄(通常的切片厚度约为15～30nm)，样品切片表面积小(样品切片长宽一般不超过50um*50um)。二是自动化钻石刀切片技术(SerialBlock-Face Scanning Electron Microscope,SBF-SEM)，它是在扫描电镜的样品切片室内安装配有钻石刀的切片机，利用该切片机实现自动连续的原位切片，该技术适用于尺寸不超过300um*300um的样品切片材料，切片厚度通常为50～100nm。三是自动化带式收集超薄切片机技术(Automatic Tape-Collecting Ultra-microtome Scanning ElectronMicroscope,ATUM-SEM)。其基本原理是将普通钻石刀与切片收集带相结合，在对树脂样品切片进行连续切片的同时用连续转动的带子对切片进行收集。该技术可以用于处理毫米级别的样品切片材料，其切片厚度约为50nm～100nm。后两种是基于钻石刀的切片技术更适用于脑组织这类大尺度样品切片的处理。但由于钻石刀的制作工艺以及出于损耗方面的考虑，目前，利用钻石刀获得的样品切片其厚度在50nm左右，而扫描电子显微镜图像在Z轴方向上分辨率取决于样品切片的厚度，因此利用该切片获得的结构的Z轴方向分辨率难以满足对样品切片细微组织结构，如神经突触这类重要组织的精确观察和分析，这已成为制约这一技术发展的一个瓶颈问题。

目前，世界上的各大电镜公司和研究单位都在探求解决扫描电镜成像Z轴方向分辨率偏低这一问题的方法。其中，最为显著的成果是美国的Gatan公司最近推出的新一代的样品切片仪器：3VIEW该仪器装备了高精度的超微切片机，它能够与扫描电镜相配合进行快速的样品切片和图像收集。该仪器目前能够处理最大尺寸为600um*600um的样品切片，但是生物样品切片的极限切片厚度只能够达到30nm。为了提高扫描电镜成像在Z轴方向上分辨率，美国的FEI公司的工程师在2012年的一个美国专利(专利号是US 8,232,523 B2)中提到了，对于生物样品切片在每次物理切割之前，通过改变扫描电镜入射电子的加速电压，收集多张电镜图片以提高样品切片在Z轴方向上分辨率的方法。根据该方法，FEI公司推出了具有射束减速模式的Teneo VS系列产品。该系列产品将超薄切割机、射束减速装置集合在扫描电镜的腔室内部，通过逐级入射电子能量的改变获得物理切割厚度范围内不同深度的样品切片结构信息，然后利用多能反卷积的图像处理方法，得到每一深度的结构信息，再通过超薄切片机的物理切割获得整个样品切片块的二维连续图像。根据该公司提供的数据证明，该方法能够有效提高生物组织块状样品切片在Z方向上的分辨率。