[发明专利]一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、脐带采集与运输；

步骤2、脐带组织的预处理；

步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的脐带采集与运输具体为：按照无菌操作要求采集脐带，符合脐带供者采集标准，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4°低温转运箱尽快送往实验室，整个过程不超过12小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的脐带组织的预处理具体为：

步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置等待绿色LED“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；

步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；

步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；

步骤2.4、用2把组织镊将组织块的表皮组织和血管内皮组织剔除干净，保留华通胶组织，放入无菌的新皿中；直至所有的组织块处理完毕，用医用手术剪，将收集的华通胶组织剪碎成2-5mm的华通胶块，以备贴壁培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的对脐带华通胶组织块进行贴壁培养具体为：

步骤3.1、配置间充质干细胞完全培养基；

步骤3.2、准备用于步骤2.4收集待贴壁华通胶组织块的T75cm²培养瓶，将华通胶组织块按间隔1-2cm间距贴在T75cm²培养瓶底面，放入37℃5.0％CO₂培养箱中孵育30分钟蒸发掉组织表面水分，促使组织块贴壁不容易脱落；

步骤3.3、将贴好华通胶组织快的T75cm²培养瓶从培养箱中取出，在生物安全柜内用10ml一次性血清移液管配上电动移液器吸取步骤3.1中配置的完全培养基，加液量10ml/T75cm²培养瓶盖好瓶盖，轻轻放入37℃5.0％CO₂培养箱中培养；

步骤3.4、每隔2-3天，对贴壁培养的培养瓶进行一次半换液或全换液，待贴壁华通胶组织块原代间充质干细胞生长密度达到85％以上，对原代间充质干细胞进行收集传代扩增培养，轻轻拍培养瓶是贴壁的组织块脱落，将培养瓶中的培养基和悬浮组织块收集到50ml无菌离心管中备用；再培养瓶中加入适量的0.9％生理盐水清洗贴壁的原代细胞，重复2遍，加入1ml0.125％胰酶消化2分钟，加入新鲜完全培养基中和，收集于新的50ml离心管用0.9％生理盐水稀释至50ml,离心1200rpm,5min弃上清，加完全培养基重悬按比例传代扩增培养；

步骤3.5、华通胶重复贴壁培养间充质干细胞原代细胞：将步骤3.4离心管中第一次贴壁原代细胞传代处理后的组织块，加入0.9％生理盐水反复清洗2遍，将组织块残余的培养液洗净，用70um或100um细胞筛滤干水分，以备进行再次贴壁；

步骤3.6、将步骤3.5中处理后的组织块，按照步骤3.2-3.5的要求重复操作，如此使每根脐带组织贴壁培养至少3-5次，即每根脐带在不同的培养阶段收获至少3-5批次的原代间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3.1中的配置间充质干细胞完全培养基具体为：将500mlLONZA无血清培养基、10mlPall血清替代物和5ml100XL-谷氨酰胺充分混合均匀，100X即每100ml培养基只需加1mlL-谷氨酰胺，制备得到间充质干细胞完全培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Pall血清替代物经过0.2um针孔式滤器过滤。