[发明专利]高效可控包装內源核酸的工程化外泌体制备及其应用

说明书

本发明涉及高效可控包装內源核酸的工程化外泌体制备及其应用。本发明公开了工程化外泌体，所述工程化外泌体包含：1)核酸分子，所述核酸分子编码与核酸药物连接的结合蛋白的核酸序列，2)与膜定位信号肽融合的CIBN融合蛋白，3)与所述核酸序列结合的蛋白融合的CRY2融合蛋白。本发明还提供包含所述外泌体的核酸药物递送系统或试剂盒，制备所述外泌体和核酸药物递送系统或试剂盒的方法，以及所述工程化外泌体或所述核酸药物递送系统递送核酸药物的用途。本发明的外泌体具有内源性、稳定性、生物相容性、纳米尺寸、跨越血脑屏障的能力以及成分的可设计性等优点。

技术领域

本发明属于药物递送领域，具体涉及一种靶向运送核酸药物如RNA药物的工程化外泌体的制备及应用。

背景技术

以核酸为基础的肿瘤治疗方法已发展到了临床试验阶段，主要包括siRNA、反义寡核苷酸(ASO)、RNA aptamer、合成mRNA和miRNA治疗等。其中，以miRNA为基础的治疗也是一种具有潜力的癌症治疗方法。其主要通过模拟或抑制靶miRNA的功能。到目前为止，一些miRNA靶向治疗也已经达到临床试验阶段，如肿瘤抑制因子miR-34模拟物(NCT01829971)和miR-16模拟物(NCT02369198)。此外，抗miRNA的寡核苷酸(AMOs)、miRNA海绵(miRNAsponge)等多种基于miRNA的疗法也广泛被研究。近年来，miRNA海绵作为一种miRNA抑制剂也表现出巨大的潜力。miRNA海绵具有重复的miRNA反义序列，可以同时靶向多个miRNA，并可以持续抑制miRNA的功能。尽管基于miRNA的治疗方法已经取得了许多成果，但它们在体内的递送仍然是一个挑战。目前，主要的递送系统由病毒递送和非病毒递送组成。病毒载体可以以高的递送效率装载内源性RNA，但安全问题需要进一步研究。非病毒递送包括基于脂质的递送、基于聚合物的递送和基于纳米颗粒的递送。它们具有低免疫毒性和良好的生物相容性，但不能负载内源性RNA，且缺乏货物保护，以及低效率的内体逃逸。因此，仍有必要开发一种新的递送系统，可以有效地装载长RNA并将其递送到靶向细胞中进行治疗。

外泌体是细胞来源的膜结合的细胞外泡，大小为30-150nm，在多泡体(MVBs)中产生，并通过MVBs与细胞膜的融合分泌到胞外液中。含有母细胞来源的蛋白质、脂类和核酸的外泌体对细胞间交流起着重要作用。大量的研究表明，功能活跃的生物分子可以通过外泌体在细胞之间交换，并在受体细胞中发挥作用。这种独特的特性使得外泌体作为天然药物递送系统受到了广泛的关注。迄今为止，外泌体已被成功地用于在体内和体外传递小分子、短RNA和蛋白质。与合成材料相比，外泌体递送系统具有多种优势，如它们具有内源性、稳定性、生物相容性、纳米尺寸、跨越血脑屏障的能力以及成分的可设计性等。然而，如何提高外泌体的有效装载及运送药物到靶点的能力仍然缺乏，目前主要使用的电穿孔和转染试剂也都存在一些问题，包括装载效率低(大分子)以及影响药物活性等。为了克服这些挑战，需要一种新的设计策略来提高药物的递送效率。

发明内容

在一些实施方案中，本发明提供工程化外泌体，所述工程化外泌体包含：1)核酸分子，所述核酸分子编码与核酸药物连接的结合蛋白的核酸序列，2)与膜定位信号肽融合的CIBN融合蛋白，3)与所述核酸序列结合的蛋白融合的CRY2融合蛋白。在一些实施方案中，膜定位信号肽可以将与其融合的蛋白如CIBN定位到细胞膜上。在一些实施方案中，膜定位信号肽可以进一步将与融合蛋白结合的其它组分如其它融合蛋白定位到细胞膜。在一些实施方案中，本发明中使用的膜定位信号肽没有特别限制，只要其能够将与其连接的多肽或蛋白定位到细胞膜并分选到外泌体中即可。在此意义上，膜定位信号肽的长度没有特别限制，其可以包括例如约5-9个氨基酸残基(肽)、10-100个氨基酸残基(多肽)或大于100个氨基酸残基(蛋白质)，这样的膜定位信号肽是本领域广泛已知的。例如，在一些实施方案中，本发明的膜定位信号肽可以是CAAX，PB，CD63，CD81，CD9，lamp2b以及Palm等。在一些实施方案中，本发明的膜定位信号肽是Palm。