[发明专利]一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法

权利要求书

1.一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH1基因在拟南芥中进行过表达；所述BnXTH1基因的完整的开放阅读框如SEQ ID NO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH1基因过表达载体的构建；

1.1)提取苎麻整株的总RNA，反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH1-F和BnXTH1-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH1的开放阅读框；

BnXTH1-F:CCCCCGGGGACATAATGTGGTCGGAAGAT；

BnXTH1-R:CGAGCTCTCAATCCCAAGGGCTCAATG；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH1片段进行酶切，酶切体系如下：

25℃反应10h后，65℃20min灭活内切酶，然后加入：

BamHI/SacI 1μL

10×NEB Buffer 1μL

ddH2O 8μL

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

25℃反应3h，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对拟南芥进行农杆菌侵染转化：

2.1)接种农杆菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.2；

2.2)4℃离心收集菌体，加入含0.03％Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.8，得到农杆菌重悬液；

2.3)对拟南芥转化前，去掉角果与盛开的花；

2.4)将拟南芥的花序完全浸入步骤2.2)得到的农杆菌重悬液中50s，套上白色薄膜，外加黑色薄膜，斜置24h，1d后去薄膜，正常培养；7天后重复浸染一次，一月后收获种子低温烘干，放4℃条件下保存。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1.6)的具体流程包括：

1.6.1)将2μL步骤1.5)提取得到的质粒加入到100μL EHA105感受态细胞中，轻弹混匀；

1.6.2)冰浴30min后，液氮速冻3min，再37℃水浴5min；

1.6.3)加入800μL无抗生素的LB培养基，200rpm、28℃震荡培养3h；

1.6.4)5000rpm离心5min，留100μL上清悬浮菌液，涂板到含利福平和卡那霉素的固体YEP培养基上，倒置28℃培养48h；

1.6.5)阳性克隆检测：挑取单菌落与10μL ddH₂O，混匀后，取2μL与25μL PCR体系，用目标基因R引物与pBI121 35S-F鉴定，剩下的混合液加入1mL含利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中扩大培养，PCR鉴定正确的菌株甘油保存；

所述pBI121 35S-F为：

pBI 121 35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC；

所述目标基因R引物为：

BnXTH1-test-R：ATGGCTGTCCACTCCTATTCC。