[发明专利]SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法

说明书

本发明涉及乳样中致病菌检测技术技术领域，是一种SDS‑PMA‑qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，其按下述步骤进行：第一步，待测乳样SDS‑PMA处理，第二步，DNA提取，第三步，qPCR扩增反应，第四步，结果测定。本发明方法在提取DNA之前，能够更好地提取DNA，提高本检测方法的灵敏性，在用PMA处理菌体之前，使用SDS能增强PMA对菌体的渗透性，并且合适的SDS浓度能够有效促进PMA对死菌的渗透效果，二者结合能够精确区分无乳链球菌活细胞和死细胞，总之，本发明方法不受待测乳样中无乳链球菌死菌的干扰，能够准确检测出并定量乳中无乳链球菌的具体含菌量，并且特异性高，可以避免假阳性结果。

技术领域

本发明涉及乳样中致病菌检测技术技术领域，是一种SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的致病菌，通常引起奶牛隐性乳房炎，它是链球菌属中最具感染力和传播速度最快的病原菌，也是人类和动物的一种重要的感染性病原菌，有可能发生食物中毒，生鲜乳中无乳链球菌的存在也是乳制品食物链中病原体的潜在来源，随之而来的是食物污染的风险。常规生物学方法是用于检测无乳链球菌的金标准，但它费力费时且特异性低，因此，建立一种快速、准确、灵敏的检测无乳链球菌方法对公众健康具有重要意义。

目前，多种快速检测方法如聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)已被视为检测乳或其他食品中无乳链球菌的可靠方法，实时荧光定量PCR(qPCR)由于其特异性和灵敏性，则可以克服常规生物学方法的这些缺点。然而，使用qPCR难以区分活细胞和死细胞，这导致了活细胞数量可能会被高估，存在假阴性和假阳性的问题。叠氮溴化丙啶(Propidium monoazide,PMA)-qPCR检测技术是近年来兴起的活菌检测技术，主要原理是PMA能穿透死细胞和受损细胞的细胞膜，在强光下与DNA形成共价键，从而抑制死细胞qPCR中DNA的扩增，而活细胞未结合DNA可在qPCR反应中被扩增和检测，以达到区分死、活菌检测的目的。然而，当细菌暴露于低致死温度时，PMA不能完全渗透到死细胞膜中，这表明在qPCR扩增阶段，并非所有来自死细胞的DNA都能被抑制，易出现检测值偏高，造成假阳性情况，而PMA浓度不适，也可能透过活菌的细胞膜与其DNA结合，出现假阴性结果，造成检测结果不准确的情况。

发明内容

本发明提供了一种SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有技术中测定乳中无乳链球菌的qPCR检测方法和PMA-qPCR检测方法容易造成结果存在假阳性或假阴性的现象的问题。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，按下述步骤进行：第一步，待测乳样处理：将待测乳样摇匀，取2mL乳样于EP管中，然后向其中加入SDS母液10⁴μg/mL 4μL、加入终浓度为10mg/mL的PMA 2μL得到混合物A，接着将混合物A于40℃恒温培养箱中避光培养20min，避光培养完成后，继续将混合物A放入冰水混合铁桶内浮漂开盖、用500W钨丝灯照射10min，照射完成后，将混合物A于1000rpm离心10min得到沉淀A，用1mL生理盐水洗涤沉淀A，再次离心5min得到沉淀B，用1.9mL TE buffer对沉淀B进行重悬得到悬浮液A，向悬浮液A中加入100μL终浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃恒温培养箱培养30min至60分钟后，于1000rpm离心10min得到沉淀C；