[发明专利]利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法

说明书

本发明公开了一种利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法，属于药用植物组织培养技术领域，该方法以怀山药试管苗为材料，通过配制培养基、灭菌、转接、设置间歇浸没生物反应器的培养参数等系列步骤，从而快速并大量获得优质怀山药组培苗。与传统液体培养相比，本发明方法具有培养周期短，繁殖系数高，组培苗成活率高等特点，并且可以减少组织培养过程的劳动量，为植物组织培养快速繁殖怀山药提供了一种低成本且高效率的方法。

技术领域

本发明属于药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法。

背景技术

山药（Dioscorea opposita）为薯蓣科薯蓣属的多年生草本植物，在国内外均有分布。本发明所使用的材料为怀山药，主产于河南省焦作市温县、武陟、沁阳、博爱、修武一带，是著名的四大怀药之一，有健脾益胃、滋肾益精、益肺止咳、降低血糖等功效。怀山药具有极高的药用价值和营养价值，且应用广泛，广销于世界各地。在长期进行营养繁殖的过程中，出现了病毒感染、产量下降、种质退化等现象。

应用植物组织脱毒快繁方法可以在一定程度上解决长期营养繁殖过程中出现的问题，有关怀山药脱毒快繁技术的研究国内已有报道。但是，应用传统植物组织培养方法生产怀山药种苗，耗费大量的人力、物力，且其生产成本一直居高不下，不利于怀山药种苗广泛应用与工厂化生产。

利用间歇浸没生物反应器成功进行其它植物培养的研究已有报道。如公开号为CN101720668A的专利公开了一种利用间歇浸没式间歇浸没培养系统进行甘蔗组织培养快繁的方法，其利用间歇浸没培养反应器对三个品种的甘蔗培养进行了介绍；公开号为CN103120126A的专利公开了一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快繁的方法。而怀山药与这两种植物均相差较大，生理、生化方面也大不相同，相应的培养方法以及培养条件也均有较大差异，故以上专利文献中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于利用间歇浸没生物反应器培育怀山药。且关于利用间歇浸没培养怀山药的报道目前在国内外还未见相关报道。

利用间歇浸没生物反应器进行怀山药种苗的生产可以弥补传统方法生产的缺陷，为低成本的生产高质量的怀山药种苗提供了有效的方法。鉴于利用间歇浸没式培养方法进行怀山药种苗的生产未见报道和公开应用，因此，有必要研究出一种利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养快速繁殖的方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种周期短、成本低且操作简单的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法，其特征在于具体过程为：

（1）按照配方基本培养液MS+激素NAA 0.1-0.5mg/mL+激素KT 0.5-1.5mg/mL+蔗糖30g/L，调整pH值5.8-6.2配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；

（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀山药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀山药茎段的接种密度为20-60个/L；

（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率3-15min/6-12h，培养时间为35-90d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃。

进一步优选，所述间歇浸没生物反应器中怀山药的接种密度为30-50个/L。

进一步优选，所述间歇浸没生物反应器的设定参数为浸没频率5-10min/6-10h。

本发明所述的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法，其特征在于具体步骤为：