[发明专利]一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法在审
申请号: | 201811040997.8 | 申请日: | 2018-09-07 |
公开(公告)号: | CN110885779A | 公开(公告)日: | 2020-03-17 |
发明(设计)人: | 秦建华;王亚清;王慧 | 申请(专利权)人: | 中国科学院大连化学物理研究所 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071 |
代理公司: | 沈阳晨创科技专利代理有限责任公司 21001 | 代理人: | 郑虹 |
地址: | 116023 *** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 器官 芯片 三维 组织 模型 构建 方法 | ||
1.一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:该模型的构建方法的主要步骤为:
(1)器官芯片的制备与修饰;
(2)拟胚体EBs的形成;
(3)类肝在器官芯片中的分化和成熟。
2.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:所述的器官芯片主要由培养液入口(1)、灌流通道(2)、柱形阵列(3)、培养液出口(4)组成,液体由培养液入口(1)进入后通过含有柱形阵列(3)的灌流通道(2),再由出口(4)流出。
3.按照权利要求2所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:所述器官芯片灌流通道宽度范围为5mm-10mm,灌流通道高度范围为1-1.3mm,柱形阵列结构中小柱直径范围为500μm-1mm,小柱高度范围为500-800μm,小柱间间距范围为50-100μm。
4.按照权利要求2所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成,上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。
5.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:步骤(1)器官芯片的制备与修饰,具体步骤为:器官芯片的制备采用传统的光刻技术,将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰,95℃烘5min,以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS;之后用PDMS聚合物反模即形成上、下层PDMS芯片;所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20-90s进行不可逆封接;封接之后,经过高温高压灭菌处理;
封接好的芯片用一定浓度的PF127修饰数小时,用培养基清洗数次浸泡过夜备用。
6.按照权利要求5所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:PF127修饰芯片的浓度范围为0.1%-2%,修饰时间为4-24h。
7.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:步骤(2)拟胚体EBs的形成,具体步骤为:采用步骤(1)制备的器官芯片,将人多能干细胞用消化液消化成单细胞,离心500-800rpm,3-5min,用商业化的mTESR1培养基重悬细胞至合适的细胞密度,并接种至已制备好的器官芯片中,细胞悬液从器官芯片培养液入口处进入,其中培养基中加入一定浓度的Y27632因子,静置培养1天。
8.按照权利要求7所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于所述人多能干细胞为人iPSCs细胞,细胞接种密度范围为2×103~6×106cells/ml,Y27632浓度范围为5-10μM。
9.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的三维类肝组织模型构建方法,其特征在于:步骤(3)类肝在器官芯片中的分化和成熟,具体步骤为:
(1)形成EBs一天后开始向内胚层诱导分化:将mTESR1培养基替换为1640+B27培养基,并连续灌流5天;
所述1640+B27培养基的基础成分为商业化的RPMI-1640培养基,需添加占总体积1%的B27;另外需添加的诱导因子为高浓度的activin-A,
(2)诱导肝前体细胞分化和增殖:在1640+B27培养基添加HGF和bFGF因子并连续灌流5天;
(3)促进肝细胞进一步成熟:1640+B27培养基更换为商业化的肝细胞培养基HCM,另外需添加OSM因子和地塞米松Dex,并连续灌流5天;
(4)类肝的长期培养:培养第15天以后,培养基去掉OSM因子,更换为只含Dex的HCM培养基,连续灌流,后续可进行长期的培养,可培养至30天并进行功能鉴定,经鉴定此方法可模拟肝的发育和形成过程。
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