[发明专利]微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法

说明书

本发明涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，包括以下步骤：分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理，末端补齐加A尾，进行接头连接；设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物，探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针，采用探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库；测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据，对比两者数据，判断微卫星位点的稳定性。本发明还涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组。本发明的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法可以减少测序深度对结果判定的影响，简单易行，准确度高，灵敏度高，成本低。

技术领域

本发明涉及一种微卫星不稳定性水平评估的二代测序方法及其所用的引物和探针，属于生物技术领域。

背景技术

微卫星是指基因组上短的重复的DNA序列，这些重复序列包括单核苷酸重复、二核苷酸重复和多核苷酸重复序列。这些重复区域在DNA复制的过程中易引起碱基对的错配，从而导致重复区域长度的变化。不过，正常人体内存在健全的错配修复(MMR)系统可修复错配引起的后果。

微卫星不稳定性(MSI)指的是DNA重复区域长度的变化，这种变化是由于MMR蛋白功能的缺失导致的，并且这种现象在结直肠癌患者中的发生概率高达20％。MSI可进一步分为高不稳定性(MSI-H)与低不稳定性(MSI-L)，检测的微卫星位点中有大于等于30％的位点表现出不稳定性定义为高不稳定性，有小于30％的位点表现出不稳定性定义为低不稳定性。

表现出MSI-H的结直肠癌患者提示为存在MMR缺陷，MSI-H肿瘤患者对化疗药5-氟脲嘧啶不敏感，需选择其他化疗方案。此外，近期研究表明，MSI-H患者在接受PD-1/PD-L1抗体时比MSI-L与MSS患者具有更好的临床反应。因此，MSI水平检测也可用于免疫检查点抑制剂类药物的辅助疗效的预测。对结直肠癌患者MSI水平进行高效准确的检测成为一种需求。

传统的MSI水平检测方法主要有：免疫组化方法，微卫星位点PCR法与Sanger测序法。传统的检测方法，不同程度的表现出一定的局限性。免疫组化方法操作复杂，特异性低；微卫星位点PCR法对通量低；直接测序法周期长、成本高且准确度低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以减少测序深度对结果判定的影响，简单易行，准确度高，灵敏度高，成本低的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，以及使用该方法的引物探针组。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，包括探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5、引物FP-1和引物UP-2；所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。

上述探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5和引物FP-1用于目的区域捕获；所述引物FP-1和引物UP-2用于扩增。

上述各探针在反应体系中的最终浓度均为200nM，各引物在反应体系中的最终浓度为400nM。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，包括以下步骤：

A.分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理，末端补齐加A尾，进行接头连接；