[发明专利]一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法

说明书

本发明公开了一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：小反刍兽疫病毒V基因原核表达载体构建pGEX–4T–V；重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE和western–blot鉴定；pGEX–4T–V蛋白纯化和浓度测定；重组pGEX–4T–V蛋白免疫小鼠制备单抗；单抗腹水的制备；小反刍兽疫V基因一个片段（已知序列）的多肽合成制备单抗；真核表达小反刍兽疫V蛋白；三株单抗间接免疫荧光和抗体分型试验等。本发明为小反刍兽疫基因工程疫苗的诊断奠定可靠的技术保障和支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法。

背景技术

小反刍兽疫(PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性、高度接触性传染病，给畜牧养殖业造成严重的经济损失。OIE将该病列为A类烈性传染病，我国将其列为Ⅰ类动物疫病。2007年7月，我国西藏阿里首次暴发了PPR。中国农业部立即公布了预防和控制PPR国家技术规范、预防和控制PPR应急计划，并从2008年在全国实施PPR监控策略。

我国目前采取弱毒疫苗(Nigera75/1)接种预防PPR，该疫苗免疫效果较好，但由于带毒与排毒给疾病的诊断及检测带来困难。活疫苗诱导机体，与病毒灭活疫苗相比，有高的和潜在的毒力返强现象，全病毒灭活疫苗将是一个更安全的替代品。当前还没有商品化的PPR 灭活苗、痘载体疫苗等，也没有关于PPRV蛋白单抗制备的相关研究，但PPR疫苗研究趋向于基因工程苗和灭活苗。

应用现有RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒总RNA中扩增V基因片段924bp(代HA标签)，克隆至pGEX-4T-1载体中，原核表达PPRV蛋白，纯化蛋白，制备了V蛋白单抗，为PPR的诊断与预防提供技术支撑。

现有技术中，还没有关于一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法。

其具体技术方案为：

一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：

(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：

根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp。应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点。上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI。下游引物加HA标签，HA序列为：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT，HA标签反转录序列：AGC GTA GTC TGGGAC GTC GTA TGG GTA。

根据Oligo 7软件设计V基因引物，上游引物P1：

AACCGAATTCATGGCAGAAGAACAAGCATACCAT；下游引物加HA标签如下，

P2：ATTTCCCGGGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCTGAGTCAGTGATGC。

突变引物M1：

突变引物M2：方框里的碱基是V基因的突变点。引物由上海生物工程有限公司合成。

(二)Nigera75/1疫苗毒(本实验室保存)RNA的提取：

TRIzol LS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶。