[发明专利]一种pGEX–4T–V重组蛋白作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法

说明书

本发明公开了一种pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法，包括以下步骤：抗原包被浓度1:1500，37℃包被2小时，弃去液体PBST洗涤3次，3min/次；5%的脱脂奶粉300ul 37℃封闭1小时，弃去封闭液PBST洗涤3次，3min/次；加检测的羊血清1:100，37℃作用45min，弃去血清PBST洗涤3次，3min/次；抗羊二抗稀释浓度1:15000，100ul/孔，25℃作用45min，弃去液体PBST洗涤3次，3min/次；加TMB显色液100ul/孔，25℃作用3‑5min；2M硫酸终止液100ul/孔，450nm测定ELISA OD值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法。

背景技术

现有国内和国外技术是应用小反刍兽疫N蛋白包被ELISA板，建立的竞争ELISA诊断方法。该方法敏感性和特异性较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法。

其具体技术方案为：

一种pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法，包括以下步骤：

⑴抗原包被浓度1:1500，37℃包被2小时，弃去液体PBST洗涤3次，3min/次。

⑵5％的脱脂奶粉300ul 37℃封闭1小时，弃去封闭液PBST洗涤3次，3min/次。

⑶加检测的羊血清(免疫过Nigera75/1活疫苗)1:100，37℃作用45min，弃去血清PBST洗涤3次，3min/次。

⑷抗羊二抗稀释浓度1:15000，100ul/孔，25℃作用45min，弃去液体PBST洗涤3次，3min/次。

⑸加TMB显色液100ul/孔，25℃作用3-5min。

⑹2M硫酸终止液100ul/孔，450nm测定ELISAOD值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明免疫的羊血清样品检测的小反刍兽疫免疫抗体效价高。本发明试验与相关报道的关键不同点就是应用的小反刍兽疫Nigero75/1疫苗毒的V蛋白。本发明采用间接ELISA方法，二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。待检测的血清则保留了它最多的免疫反应性。操作简便。

与商品化试剂盒的对比情况：pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的(V-间接ELISA)检测方法和ID.vet公司的竞争ELISA试剂盒检测对比结果，172份羊血清样品检测结果符合率达到97.6％。

附图说明

图1是pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法的流程图；

图2是pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板检测羊血清的结果。

图3是pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板(V-间接ELISA)检测方法和ID.vet公司的竞争ELISA检测羊血清样品80个的对比的结果。

图4是pGEX–4T–V作为抗原包被ELISA板(V-间接ELISA)检测方法和ID.vet公司的竞争ELISA检测羊血清样品92个对比的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。