[发明专利]基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用

权利要求书

1.基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合，其特征在于：所述引物组合由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：

F3: 5'- CAGTATTCTGGCGGGCATG-3'，

B3: 5'- ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3'；

FIP:5'-TGGGGAACGCGAATTAACGCGGAGCGTCATTTCAACCCTCA-3'，

BIP:5'-GTCACGTCGAGCTTCCATAGCGAGAAGTTGGGGTTTAACGGC-3'。

2.如权利要求1所述的引物组合在多肉植物茎腐病菌LAMP检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其检测方法包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA；

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，反应体系中包含：20 mM Tris-HCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、8.0 mM MgSO₄、50 mM KCl、0.8 mM 甜菜碱、1.75mmol·L^-1 dNTPs、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 μmol·L^-1的FIP和BIP、0.2 μmol·L^-1的F3和B3，1μL模板DNA50-100 ng，无菌双蒸水补充至25 μL，在PCR管盖上加入2 μL的1000×SYBRGreenⅠ；

（3）LAMP反应条件：65 ℃温育60 min，85℃灭活10min，冰上终止反应；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定；采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，瞬时离心，将SYBR GreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。

4.如权利要求1所述的引物组合在多肉植物茎腐病菌的早期诊断、监测和鉴定上的应用。