[发明专利]一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法

说明书

本发明公开了一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法。所述引物如SEQ ID NO:3‑4所示。本发明通过引物PCR扩增获得日本鳗鲡IFN‑γrel基因序列，构建pET32a原核表达载体，转化到大肠杆菌培养，通过诱导条件的优化，可大量表达日本鳗鲡IFN‑γrel重组蛋白，通过镍柱纯化并优化纯化条件获得高纯度高质量的蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程重组领域，尤其涉及一种用于扩增日本鳗鲡干扰素相关因子的引物和制备方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一类由病毒诱导产生具有抗病毒作用的细胞因子。根据其序列特征和功能差异，哺乳动物干扰素分为I型、II型和III型三大类。I型干扰素主要包括IFN-α/IFN-β等。II型干扰素(Interferon，IFN)，即IFN-γ，是一类二聚化的可溶性细胞因子，主要由T淋巴细胞和NK细胞分泌，具有抗病毒和免疫调节作用。III型干扰素即IFN-λ，由IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4组成。

在哺乳动物中，II型干扰素只有一种类型，即IFN-γ，由一个基因编码，包含有4个外显子和3个内含子。与哺乳动物不同的是，鱼类的II型干扰素存在两个IFN-γ基因(IFN-γ1和IFN-γ2)，与哺乳动物同源的IFN-γ命名为IFN-γ2，而IFN-γ1由于与高等脊椎动物同源性很低，所以又被命名为干扰素相关因子(IFN-γrel，IFN-related molecule)。IFN-γrel首次在斑马鱼(Danio rerio)和绿河豚(Tetraodon nigirovirdis)中被发现。随后在大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤(Cyprinus carpio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、金鱼(Carassius auratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、日本鲫(Carassius auratus langsdorfii)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)等中均鉴定出两个IFN-γ基因。已有的研究表明，二者的结构、功能、信号转导存在差异：(1)结构：与IFN-γ不同，IFN-γrel基因的C端缺乏核定位信号(NLS)结构域，这使其丧失了诱导趋化因子的能力。与其他鱼类的IFN-γrel相似，日本鳗鲡IFN-γrel的C-端也缺乏NLS；(2)功能：在免疫原刺激下，斑马鱼IFN-γ和IFN-γrel基因在各组织中的表达水平有所不同，表明其功能可能存在差异。在鲤中发现IFN-γrel主要由IgM⁺细胞产生，而IFN-γ主要在IgM^－细胞中检测到，表明IFN-γrel主要调控体液免疫应答。IFN-γrel处理金鱼单核细胞后，可引起CXCL-8，IL-1β表达上调，而这些基因对IFN-γ的刺激无应答。金鱼IFN-γ能产生持久的反应氧中间体(Reactive Oxidant Intermediates，ROI)效应，而IFN-γrel只能产生短暂的ROI效应随后快速下调。(3)信号转导：有研究显示硬骨鱼类的两个IFN-γ基因分别有其特异性的受体而不是共用相同的受体。在斑马鱼及金鱼中发现了2个IFNGR1基因，即IFNγR1-1/CRFB17和IFNγR1-2/CRFB13，它们能分别和不同的II型干扰素配体结合。金鱼的IFNγR1-1特异性结合IFN-γrel，IFNγR1-2特异性结合IFN-γ。Grayfer等发现IFN-γ能诱导金鱼单核细胞中IRF1和IRF8表达上调，而IFN-γrel却不能。此外，IFN-γrel与IFN-γ都能诱导STAT1的磷酸化，但是STAT1的核定位仅发生在IFN-γ处理过的单核细胞内，这说明金鱼IFN-γrel的细胞信号途径可能不同于IFN-γ。