[发明专利]抑制miR-449家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用

说明书

本申请针对miR‑449家族分子miR‑449a、miR‑449b和miR‑449c，设计了与之具有完全配对序列和非完全配对序列的寡核苷酸元件，并进一步设计了包含该寡核苷酸元件的寡核苷酸序列，统称miR‑449海绵。本申请还设计了包含该miR‑449海绵的核酸构建体。该miR‑449海绵或该核酸构建体在生物体体内细胞或体外培养细胞中表达，能有效地结合细胞中的miR‑449家族分子，抑制这些miR‑449家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，可以作为一种试剂工具，用于研究miR‑449调控肿瘤发生发展、生物个体发育等的分子机制研究。该miR‑449海绵也可以用来制备用于抑制miR‑449家族分子的药剂。因此，本申请还提供了包含该miR‑449海绵或该核酸构建体的试剂盒或药物组合物。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种能抑制miR-449家族分子的功能的microRNA海绵、包含该microRNA海绵的核酸构建体及其应用。

背景技术

MicroRNA(简称miRNA或MiR)是一类由19-25个核苷酸组成的短的非编码RNA片段。它作为生物体内广泛存在的转录后调控因子，在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生、肿瘤迁移、器官形成、器官衰老、疾病发生等各种生物学事件中发挥着重要的调控作用。microRNA的产生机制相对保守。首先，编码microRNA的基因在核内转录成pri-miRNA。然后，pri-miRNA在Drosha RNase III酶及辅助因子DGCR8的作用下，剪切为约70个核苷酸长度、具有茎环结构的microRNA前体，即pre-miRNA。然后，pre-miRNA在依赖Ran-GTP的核质/胞质转运蛋白Exportin 5的作用下，从核内运输到胞质中，在细胞质中由Dicer酶将pre-miRNA剪切成大约21个核苷酸长度的双链microRNA。起初，成熟microRNA与其互补序列形成双螺旋结构。随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称RISC复合物。该复合物结合到目标靶mRNA上，在大多数情况下该复合物中的单链microRNA与靶mRNA的3'UTR发生不完全互补配对，从而阻断该靶mRNA的翻译过程或导致该靶mRNA的剪切和降解。

miR-449是哺乳动物一个保守的microRNA基因家族，表达3个同源的microRNA分子，即miR-449a、miR-449b和miR-449c。miR-449家族分子在多种肿瘤如结直肠癌、肺癌以及个体发育中具有重要的调控作用。因而，开发针对miR-449家族分子的miR-449海绵，有望用于抑制micR-449家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，可以作为一种工具用于研究miR-449调控肿瘤发生发展、生物个体发育等的分子机制研究，或者用于基于阻断miR-449生物学功能的医疗用途。

发明内容

为抑制miR-449家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，本发明提供一种抑制miR-449家族分子的microRNA海绵，并提供了包含该microRNA海绵的核酸构建体，以及包含该microRNA海绵或该核酸构建体的试剂或药物组合物。

因此，在一个方面，本发明提供一种抑制miR-449家族分子的microRNA海绵，该microRNA海绵包含以下寡核苷酸元件：CCAGCTA序列-ACTAT序列-CACTGCC序列，其中所述CACTGCC序列和所述CCAGCTA序列与miR-449家族分子完全配对，所述ACTAT序列与miR-449家族分子不完全配对。

在一个实施方案中，miR-449海绵包含1个寡核苷酸元件，具有以下核苷酸序列(其中下划线部分表示ACTAT序列)：

5’-CCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.1)。

在一些实施方案中，miR-449海绵包含2-20个该寡核苷酸元件，相邻的寡核苷酸之间由间隔序列ACGCG隔开。