[发明专利]抗人PLGF单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA检测法检测血清中抗体效价，取效价高的小鼠免疫脾细胞；

(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞融合前1天，进行细胞换液并使骨髓瘤细胞在融合当天为对数生长阶段；

(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用5ml HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*10⁵个/mL，将饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用；

(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完毕，将融合细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO₂的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；

(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，选择OD值高的杂交瘤细胞进行亚克隆；

(6)亚克隆：采用软琼脂法进行杂交瘤细胞的亚克隆，阳性孔继续进行2-3次克隆化，直至100％杂交瘤细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；

(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞经过滤离心处理后，再通过protein-A亲合层析柱分离纯化PLGF单克隆抗体，纯化后，经SDS-PAGE测定PLGF单克隆抗体纯度大于93％。

2.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每次免疫时，小鼠的接种剂量为50或100ug/只。

3.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，饲养细胞的制备方法为通过颈脱位处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min，弃上清，用5ml HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*10⁵个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用。

4.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，50％聚乙二醇PEG4000的加入量为1ml。

5.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，HAT完全培养液为98ml完全RPMI-1640培养基、1ml HT贮存液、1ml A贮存液的混合液，HT完全培养液为99ml完全RPMI-1640培养基、1ml HT贮存液的混合液。

6.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，过滤膜的孔径为0.22um，离心速度为1500rpm/min，离心时间为10min。