[发明专利]基于AAV病毒的基因编辑表达盒在审
| 申请号： | 201811054096.4 | 申请日： | 2018-09-11 |
| 公开（公告）号： | CN110885818A | 公开（公告）日： | 2020-03-17 |
| 发明（设计）人： | 褚贝贝;杨国宇;王江;刘忠虎;汪新建;钟凯;鲁维飞;郭豫杰 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京永新同创知识产权代理有限公司 11376 | 代理人： | 程大军;栾星明 |
| 地址： | 450002*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 aav 病毒 基因 编辑 表达 | ||
1.一种表达盒，其包含分别位于表达盒5'端和3'端的两个反向末端重复(ITR)，以及位于两个反向末端重复之间的第一启动子、和与第一启动子可操作地连接的编码Cas9多肽的第一多核苷酸、及第二启动子、和与第二启动子可操作地连接的编码单向导RNA(sgRNA)的第二多核苷酸，其中所述表达盒的大小不超过4.3kb。
2.权利要求1的表达盒，其中所述Cas9多肽为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(SaCas9)，如SEQ ID NO:7所示，其任选地与核定位序列(NLS)连接，并且所述sgRNA为SaCas9对应的sgRNA。
3.权利要求1的表达盒，其中所述第一启动子和所述第二启动子的大小总共不超过300bp。
4.权利要求1的表达盒，其中所述第一启动子是SEQ ID NO:5所示的EF1α启动子。
5.权利要求1的表达盒，其中所述第二启动子是tRNA编码序列。
6.权利要求5的表达盒，其中所述tRNA编码序列是哺乳动物的tRNA，例如Gln tRNA、ProtRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、Cys tRNA、或Glu tRNA。
7.权利要求5的表达盒，其中所述tRNA编码序列是SEQ ID NO:4所示的Gln tRNA。
8.权利要求1的表达盒，其中所述第二启动子是小鼠γ疱疹病毒-68(MHV68)RNA。
9.权利要求1的表达盒，其中位于表达盒5'端的反向末端重复AAV2 ITR 5'序列如SEQID NO:2所示，位于表达盒3'端的反向末端重复AAV2 ITR 3'序列如SEQ ID NO:3所示。
10.权利要求1的表达盒，其中所述第一多核苷酸还与报告分子符合读码框地连接，所述报告分子大小不超过800bp。
11.权利要求10的表达盒，其中所述报告分子选自EGFP、mCherry和NanoLuc。
12.权利要求1的表达盒，其从5'-3'方向按顺序包含AAV2ITR 5'、EF1α启动子、与EF1α启动子可操作地连接的SaCas9表达序列、tRNA编码序列、与tRNA编码序列可操作地连接的SaCas9对应的sgRNA、以及AAV2ITR 3'。
13.权利要求1的表达盒，其包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
14.一种重组载体，其包含权利要求1-13任一项的表达盒。
15.权利要求14的重组载体，其中所述载体是腺相关病毒载体。
16.一种试剂盒，其包含权利要求1至13任一项的表达盒或权利要求14至15任一项的重组载体。
17.一种基因编辑的方法，包括将权利要求1至13任一项的表达盒或权利要求14至15任一项的重组载体递送至对象的细胞的步骤。
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