[发明专利]CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法有效
申请号: | 201811054625.0 | 申请日: | 2018-09-11 |
公开(公告)号: | CN109321519B | 公开(公告)日: | 2021-01-08 |
发明(设计)人: | 肖志华;梁欠欠 | 申请(专利权)人: | 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 |
主分类号: | C12N5/077 | 分类号: | C12N5/077 |
代理公司: | 上海光华专利事务所(普通合伙) 31219 | 代理人: | 张新鑫;许亦琳 |
地址: | 201321 上海*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | cho k1 悬浮 驯化 培养基 方法 | ||
1.一种CHO-K1悬浮驯化无血清培养基,其特征在于,所述培养基由以下重量份或浓度的组分组成:
2.一种CHO-K1悬浮驯化培养基,其特征在于,所述CHO-K1悬浮驯化培养基为将权利要求1所述无血清培养基添加不超过无血清培养基总重量10%的血清获得。
3.一种CHO-K1细胞驯化方法,所述方法至少包括以下步骤:
(1)对CHO-K1细胞贴壁降血清三级培养,降血清三级培养是指对CHO-K1细胞分3次培养,将CHO-K1细胞在含有10%FBS的F-12K培养基中培养,当细胞汇合度到70~80%时,加胰酶消化,缓慢吹打混匀,以0.4×105cells/ml的密度接种至10ml含10%FBS的F-12K培养基中传代,静止培养,当细胞汇合度到70~80%,加胰酶消化并以同样的密度接种至10ml含5%FBS的F-12K培养基中,用同样的方法将血清逐步降低至2.5%,培养3代;
(2)悬浮驯化:将CHO-K1细胞置于如权利要求2所述的培养基中悬浮培养;所述培养基中血清添加量为权利要求1所述的培养基重量的1~3%,条件培养基(Condition Medium,CM)制备:细胞在含有2.5%FBS的F-12K培养基2-3天后,收集培养上清200g离心5分钟后,用0.22um的无菌滤膜过滤;
(3)悬浮除血清培养:将CHO-K1细胞依次置于血清添加量为无血清培养基重量的1~3%的如权利要求2所述的培养基、权利要求1所述的培养基、按权利要求1所述的培养基减除IGF-1、泊洛沙姆188成分配制的M培养基中培养,取1%FBS条件下细胞培悬液以200g水平离心5mins,收集上清,经0.22μM的一次性过滤器过滤,作为此阶段条件培养基。
4.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法,其特征在于:所述步骤(1)、(2)以及(3)中每次培养细胞至细胞传代2~3次后进入后续步骤。
5.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法,其特征在于:所述步骤(1)中培养条件为36~38℃,体积分数为5~8%CO2,pH为7.0~7.4,培养箱中静置培养,所述步骤(2)中培养条件为36~38℃,体积分数为5~8%CO2,pH为7.0~7.4,置于摇床中培养,转速为110~130rpm,所述步骤(3)中培养条件为36~38℃,体积分数为5~8%CO2,pH为7.0~7.4,置于摇床中培养,转速为110~130rpm。
6.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法,其特征在于:所述步骤(2)中培养时,当细胞密度低于5×105cells/ml或者细胞活率低于50%,应加入细胞至活细胞数不低于10×105cells/ml。
7.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞驯化方法,其特征在于:所述步骤(3)还包括将细胞在M培养基中培养之后置于CD CHO Medium中培养。
8.如权利要求1所述的CHO-K1悬浮驯化无血清培养基以及如权利要求2所述的CHO-K1悬浮驯化培养基用于CHO-K1细胞驯化培养的用途。
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