[发明专利]基于核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略的TP53检测方法

说明书

本发明公开了基于核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略的TP 53检测方法，包括以下步骤：1)制备含金纳米颗粒的金胶；2)用DNA探针修饰金纳米颗粒；3)将颈环DNA、TP 53混合于缓冲液，加入核酸外切酶III，制得反应溶液；4)DNA探针修饰的金胶溶液混合，并加入氯化锌继续反应；5)进行荧光信号的测量。本发明通过核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略，将待测物质TP 53浓度的检测限大大降低。本发明用于检测TP 53具有灵敏度高、快速、成本低的特点，检测限为21fM，通过设计的核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略和荧光光谱技术的结合，可以实现TP 53生物传感的应用。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略的TP 53检测方法。

背景技术

人类TP 53位于17号染色体上，癌症患者体内的TP 53基因常常发生显著的突变。研究表明，TP 53在乳腺癌以及卵巢癌的发生和恶化的过程中均扮演着重要的角色。TP 53不仅可以作为一种癌症早期诊断的标志物，同时可以用于监测癌症的发展以及癌症病人预后反应。因此，开发TP 53快速、准确的检测方法在生物学以及临床诊断方面均有显著的意义。传统的TP 53检测方法有高效液相色谱法、变性梯度凝胶电泳以及免疫组织化学法等，然而这些方法面临着诸多问题，如成本昂贵，仪器要求高、灵敏度不高，操作复杂等。近年来，荧光光谱技术发展迅速，具有许多优点，如高灵敏度、快速响应和使用价格低廉的仪器和试剂。另一方面，基于外切酶III以及核酶构建的双重信号放大体系可显著提高检测的灵敏度。因此本发明开发出了一种选择性和敏感性高的检测TP 53的新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略的TP53检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于核酸外切酶III以及核酶双重信号放大策略的TP 53检测方法，该方法先设计颈环DNA以及荧光染料标记的DNA探针；然后将DNA探针修饰至金纳米颗粒表面，荧光染料由于靠近金纳米颗粒其荧光发生猝灭；待检基因TP 53存在时，TP 53与颈环DNA互补配对，通过外切酶III切割颈环DNA，TP 53以及被切割的颈环DNA被释放并与未被切割的颈环DNA继续结合进入下一循环；被切割的颈环DNA暴露出核酶序列，与金纳米颗粒表面上的DNA探针结合而后发挥核酶的活性对DNA探针切割，荧光染料会远离金纳米颗粒，其荧光恢复；最后进行荧光测量实现TP 53的检测。

优选的是，所述方法包括以下步骤：

1)制备含金纳米颗粒的金胶；

2)用DNA探针修饰金纳米颗粒，制得核酸修饰的金胶溶液；

3)将颈环DNA、TP53混合于缓冲液，加入核酸外切酶III，制得反应溶液；

4)将所述步骤3)制得的反应溶液与所述步骤2)制得的核酸修饰的金胶溶液混合，并加入氯化锌继续反应；

5)对所述步骤4)反应后的溶液进行荧光信号的测量。

优选的是，所述步骤1)具体包括：将100mL 10mg/mL的HAuCl₄油浴至沸腾，剧烈搅拌；然后向其中快速加入3.5mL 10mg/mL的柠檬酸钠，保持沸腾15分钟，然后停止加热，30分钟后停止搅拌，静置过夜，制得含金纳米颗粒的金胶，并放置到4℃冰箱中避光保存。

优选的是，其中，金纳米颗粒的直径为13±2nm。