[发明专利]三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法

说明书

本公开提供了三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法。所述试剂盒包含三组引物和探针的组合，其中两组引物和探针的组合是以选自人类SEPT9基因序列范围内的两个区域为靶点设计的引物和探针的组合，另一组引物和探针的组合是以内部参照基因为靶点设计的引物和探针的组合。所述试剂盒能够更敏感和准确地确定特定区域DNA甲基化水平或状态。

技术领域

本公开属于医药生物领域，具体而言，主要涉及DNA甲基化检测试剂盒和方法，特别是人的液体活组织检查中与大肠癌相关的目标基因Septin9(SEPT9)的DNA甲基化检测方法以及用于检测目标基因SEPT9的DNA甲基化的试剂盒。

背景技术

大肠癌(CRC)是全世界第三大常见癌症，每年有600,000人死亡。对于CRC，早期识别和早期干预是降低死亡率的最佳方法。目前的筛查方法是结肠镜检查和大便隐血和免疫组织化学检测(gFOBT/FIT)。由于结肠镜检查的不适以及对肠道制品的厌恶，这些筛查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基础检测来评估CRC风险对于早期发现CRC可能是有价值的。

DNA甲基化改变是癌症中最早的分子变化之一。肿瘤抑制基因的高甲基化已被确定为抑制基因表达并促进癌细胞生长和扩张的机制。

在CRC中，SEPT9，SFRP2，TFPI2，NDRG4，BMP3和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的超甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，一个或多个这些基因的甲基化状态分析，可用于辅助诊断大肠癌的状态。

目前用于诊断及检测结果的困难度来自于组织活检的侵入性。液体活检可解决这个问题，其中用于分析的生物样本，可从血液，尿液，唾液，痰液或组织样本等获得。

传统的诊断癌症方法相比，液体活检有一些主要的优势：

1.易取得，液体活检也可从尿液，唾液和胸腔积液获得；

2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；

3.能取样所有可能的癌细胞，而不非仅局限于肿瘤活检的某部分；

4.允许早期发现癌症；

5.能用于监测肿瘤动态(治疗前，治疗间和治疗后)；

6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。

人类生物样本包含，源自所有组织(包括癌症组织)的细胞、蛋白质、外来体和游离DNA(cfDNA)、游离RNA(cfRNA)。游离DNA的浓度非常低，在血浆约至1-10ng/mL。肿瘤突变DNA可以在来自癌症患者的生物样本的cfDNA中检测到，被称为循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA,即ctDNA)。这些ctDNA为大约134-144bp的DNA片段，而其浓度更可小于cfDNA。

临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战，仍在于开发灵敏的检测方法在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断。此外，目前可用的检测试剂盒受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差或用于检测甲基化DNA的设计不佳的定量PCR方法的限制。