[发明专利]一种嵌合蛋白AQP4-CH2、制备及其应用

说明书

本发明涉及一种嵌合蛋白AQP4‑CH2、制备及其应用，属于生物医药工程技术领域。本发明首先利用蛋白质三维结构模拟，将AQP4的三段抗原表位(A环、C环和E环)取代人抗体恒定区CH2中不规则卷曲，使其展示在CH2蛋白表面；然后人工合成密码子优化的嵌合蛋白基因，利用分子克隆技术，构建原核表达载体；转化大肠杆菌筛选高效表达嵌合蛋白菌株，Ni‑亲和层析纯化嵌合蛋白AQP4‑CH2；以嵌合蛋白为抗原包被酶标版，采用酶联免疫分析(ELISA)法测定视神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中的AQP4抗体，用于早期鉴别诊断视神经脊髓炎与多发性硬化。

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体地，涉及一种嵌合蛋白AQP4-CH2、制备及其应用。

背景技术

视神经脊髓炎主要累及视神经与脊髓，是一种炎性脱髓鞘性疾病，其主要临床表现为亚急性发病的不同程度的视力障碍、双下肢瘫痪、感觉及二便障碍，由于其与多发性硬化在临床症状上具有相似性，临床上对两者是否为同一疾病的不同亚型存在广泛的争议。近年来随着视神经脊髓炎病例报道的增多以及相关研究的进展，视神经脊髓炎在临床经过、神经影像学、血清学、免疫病理学等方面均与多发性硬化表现不一致。视神经脊髓炎受累的脊髓节段比较长，长度在３个或３个以上椎体节段，称之为纵向扩展性横贯性脊髓炎，与之不同的是，多发性硬化的病灶以大脑半球为主，脊髓病灶很少超过２个椎体，且多位于脊髓周边。然而，由于视神经脊髓炎早期可出现脑部病灶，其与多发性硬化的预后有很大不同，因此，寻找能够帮助早期诊断、鉴别的生物学标志将有助于对患者的治疗。

水通道蛋白4（AQP4）是一种糖蛋白，是分布于中枢神经系统的高选择性的水跨膜转运通道蛋白，相对分子质量约为30 000，含有301个氨基酸。分子结构呈四聚体，其中每个单体都具有独立的转运水通道活性。其一级结构由5个环(A、B、C、D和E)连接6个跨膜区段构成，包括2个胞内环(B和D)和3个胞外环(A、C和E)，B和D环与羧基、氨基末端均在胞内，A、C和E环位于胞膜外侧，是AQP4的主要抗原表位。6个跨膜区包绕着B和E环形成一个桶状结构作为水分子通道。B和E环呈疏水性，其任何变化都会引起水通道活性的下降，其余环为亲水性。肽链的氨基端和羧基端由相似的重复序列构成，各自拥有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)特征性序列，该序列是AQP家族共有的特征性结构，对水的通透性具有决定性作用。氨基端和羧基端在结构上彼此呈180°中心对称排列，氨基酸序列经过约40% α螺旋和42% β片层及转角构成其二级结构，同源的四聚体再构成AQP4的三级结构。AQP4主要表达于脑膜表面、室管膜和脑室周围，其他在下丘脑视上核、小脑、海马齿状回、中缰核、脉络丛上皮、视网膜及视神经也可有表达，不同部位的AQP4发挥各自功能，共同参与脑脊液的分泌、分布与重吸收，此外，对于脑内渗透压、Ｋ+的平衡及脑水肿的病理机制起到重要调节作用。

水通道蛋白4抗体（AQP4 Ab）又称视神经脊髓炎特异性抗体，是Lennon等于2004年发现的。AQP4抗体能激活补体系统，引起中枢神经系统炎性脱髓鞘和坏死，诱导星型胶质细胞的损害。AQP4抗体存在与视神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中，对于早期诊断鉴别视神经脊髓炎与多发性硬化具有重要意义。临床上对水通道蛋白４抗体的检测方法的研究较为广泛，目前的检测方法有细胞免疫共沉淀法、放射免疫共沉淀法、组织间接免疫荧光检测、细胞免疫荧光法及酶联免疫吸附测定法等，各种方法优缺点不同。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的在于提供一种嵌合蛋白AQP4-CH2，该蛋白是在人抗体恒定区CH2表面展示AQP4抗原表位；

目的二在于提供制备上述嵌合蛋白AQP4-CH2的方法；

目的三进一步提供上述嵌合蛋白AQP4-CH2的应用，作为包被抗原用于AQP4抗体检测，可用于视神经脊髓炎与多发性硬化早期鉴别诊断。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：